甘薯IbHQT1啟動子的克隆及上游調控因子的鑒定

徐靖 朱紅林 林延慧 唐力瓊 唐清杰，2 王效寧，2

（1. 海南省農業科學院糧食作物研究所 海南省農作物遺傳育種重點實驗室，?？?571100；2. 海南省農業科學院三亞研究院，三亞 572000）

綠原酸是廣泛存在于植物中的酚類化合物，具有抗菌、抗病毒、活血降壓、抑制腫瘤和清除自由基等生物活性［1-3]。隨著對天然抗氧化劑需求量的增加，從植物中提取的綠原酸供不應求。甘薯（Ipomoea batatas L.（Lam.））莖、葉和塊根中均含有綠原酸類物質，能夠成為提取綠原酸類物質的新資源［4-5]。甘薯中的綠原酸可以降低餐后血糖，同樣也顯示出較好的抗氧化能力，其含量已成為評價菜用甘薯品質的一個重要指標［6-9]。此外，綠原酸等酚類物質的存在能夠提高甘薯的抗病和抗蟲害能力［10-12]。目前，甘薯綠原酸的研究主要集中在生物活性方面，但其生物合成途徑和分子調控機制還不清楚［13-14]。揭示甘薯綠原酸的生物合成和調控途徑，挖掘綠原酸積累相關基因，對開展高綠原酸甘薯新品種的選育具有重要意義。

羥基桂皮酰輔酶A羥基桂皮酰轉移酶（hydroxycinnamoyl CoA quinate hydrocycinnamoyl transferase,HQT）是植物綠原酸生物合成的關鍵酶。在蒲公英、馬鈴薯、金銀花和煙草等植物中過表達或抑制HQT后綠原酸含量發生明顯提高和降低［15-21]。轉錄因子可激活類黃酮、單寧和木質素等次生代謝物生物合成途徑中多個酶基因協同表達，在苯丙素類物質生物合成中起著重要的調控作用［22-23]。目前，對類黃酮生物合成調控的研究比較深入，其合成途徑中的PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR等關鍵酶基因的表達受到MYB、bHLH、WD40、WRKY、NAC和bZIP等轉錄因子的調節［24]。

前期研究表明，甘薯中存在2個HQT編碼基因，其中，HbHQT1可能是甘薯綠原酸生物合成的關鍵基因［25]，但對其表達調控仍不清楚。

本研究利用酵母單雜交技術在甘薯葉cDNA酵母文庫中篩選與HbHQT1啟動子結合的上游轉錄調控因子，為進一步揭示HbHQT1在甘薯綠原酸生物合成中的作用和轉錄調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

甘薯（QS80-12-11）是海南本地種植的菜用甘薯品種，種植于海南省農業科學院永發實驗基地海南省甘薯種質資源保存圃內，生長60 d后，取甘薯葉片洗凈表面后用液氮速凍后，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA文庫構建 采用Trizol法提取甘薯葉RNA，通過核酸蛋白檢測儀NanoDrop 2000C檢測RNA純度和完整性。按照DynabeadsTMmRNA純化試劑盒說明書進行mRNA的分離純化，用酵母單雜交文庫構建試劑盒進行雙鏈cDNA的合成和純化，將雙鏈cDNA與pGADT7-Rec線性質粒載體共轉化酵母菌Y187中進行cDNA文庫構建，并對文庫質量進行鑒定。

1.2.2 IbHQT1啟動子的克隆及誘餌載體的構建 根據甘薯基因組數據（https://sweetpotao.com/download_genome.html）中IbHQT1翻譯起始密碼子上游約1500 bp啟動子序列設計特異引物P1（5'-CACACTGGTTTGAGAAGTG-3'）和P2（5'-TTAAACTTCTCACTTGCCAT-3'），以甘薯（QS80-12-11）基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經電泳檢測后切膠回收，連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行菌液PCR驗證，陽性克隆送至中美泰和生物技術（北京）有限公司進行測序。利用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/PLACE）對啟動子區順式作用元件進行預測。將IbHQT1啟動子序列通過同源重組的方法連接到pHIS2載體中，獲得pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體。

1.2.3 酵母單雜交文庫的篩選 將pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體轉入Y187菌株中制備誘餌菌株，陽性克隆稀釋后涂板至添加不同濃度（0、50和75 mmol/L）3AT的SD/-Trp-His平板上，測定能夠抑制HIS3表達的最低3-AT濃度。將文庫質粒轉入誘餌菌株，涂在含有合適3-AT的SD/-Leu-Trp-His平板上，30℃ 3-5 d后，挑取能夠正常生長的單菌落進行復篩，仍能夠繼續正常生長的視為互作蛋白。最后，進行菌落PCR檢測，將具有單一條帶且大于1000 bp的PCR產物進行基因測序。測序結果通過NCBI Blast進行同源檢索，篩選潛在的轉錄調控因子。

1.2.4 陽性克隆的酵母單雜交驗證 將候選互作轉錄因子基因連接到pGADT7載體并轉入pHIS2-IbHQT1pro誘餌菌株，在SD/-Trp-His平板上30℃倒置培養3-5 d，轉移單菌落在含有3-AT的SD/-Leu-Trp-His平板上進行復篩，驗證候選互作基因與IbHQT1啟動子的結合的真實性。

1.2.5 基因表達及相關性分析 根據已發表的數據［25]，提取基因表達和綠原酸含量數值，利用EXCEL軟件中的CORREL函數來計算兩者之間的相關性系數，利用在線軟件Chiplot（https://www.chiplot.online/）繪制相關性熱圖。

2 結果

2.1 IbHQT1啟動子的克隆與順式作用元件分析

根據IbHQT1上游序列設計引物，通過PCR進行擴增獲得目的片段，并連接pMD19-T載體進行測序，結果表明，IbHQT1起始密碼子1500 bp啟動子序列已成功克隆。序列分析顯示，IbHQT1啟動子中除了包含典型的真核生物啟動子順式元件CAATbox和TATA-box外，還存在水楊酸響應元件TCAelement、赤霉素響應元件TATC-box、乙烯響應元件ERE、茉莉酸響應元件CGTCA-motif、生長素反應元件AuxRR-core和脫落酸響應元件ABRE，脅迫響應元件STRE和TC-rich repeats及多個光響應元件如AE-box、Box 4、GATA-motif和G-box。此外，IbHQT1啟動子還含有AAAG/CTTT、RAA、W-Box、MBS、MYC和TGACG元件（圖1），這些元件可以被DOf、ERF、WRKY、MYB、MYC和TGA轉錄因子識別。結果表明，IbHQT1的表達可能受到上述激素和轉錄因子的調控。

圖1 IbHQT1啟動子序列及主要順式元件Fig. 1 Promoter sequences of IbHQT1 and main cis-elements

2.2 pHIS2-IbHQT1pro誘餌質粒3AT濃度篩選

將1500 bp的IbHQT1啟動子與酵母單雜交載體pHIS2連接，構建誘餌載體pHIS2-IbHQT1pro。將構建成功的pHIS2-IbHQT1pro質粒轉化Y187酵母菌，并涂平板培養3 d后，隨機挑取3個單菌落稀釋后涂板至不同濃度（0、50和75 mmol/L）3AT的SD/-Trp-His平板上，30℃培養3 d。結果顯示，隨著3AT濃度增加，轉化子數量明顯減少（圖2-A，B），而當3AT添加到75 mmol/L時轉化子基本不生長（圖2-C），表明75 mmol/L的3AT濃度可以有效抑制HIS3報告基因的表達，該濃度可用于后續文庫篩選。

圖2 pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體自激活檢測Fig. 2 Self-activation of pHIS2-IbHQT1pro bait vector

2.3 酵母單雜交文庫構建和質量鑒定

核酸濃度檢測顯示OD260/280為1.94，OD260/230為2.27，28S/18S為2.27，說明總RNA質量和純度較好，可用于構建酵母單雜交cDNA文庫。將純化后的雙鏈cDNA與線性化的pGADT7-Rec2載體共轉化酵母菌，經篩選后，獲得230個單菌落，總庫容量為1.15×107CFU，大于107。挑取平板上的單克隆進行PCR擴增和檢測，結果表明，平均插入片段大于1200 bp，陽性率為100%（圖3），說明酵母單雜交文庫構建成功，可以用于下一步試驗。

圖3 文庫插入片段長度的PCR 檢測Fig. 3 Detection of inserted fragment lengths in the library by PCR

2.4 酵母單雜交文庫互作蛋白的初步篩選

利用共轉化方法將25 μg文庫質粒和5μg pHIS2-IbHQT1pro誘餌質粒共轉化Y187酵母感受態細胞。將轉化產物在含75 mmol/L的3AT的SD/-Trp-Leu-His平板上培養3-5 d，初步篩選獲得17個轉化子，將這些陽性克隆轉化子分別用無菌水稀釋后進行點板復篩，發現17個轉化子均能在添加3-AT的篩選平板上旺盛生長（圖4-A）。對17個陽性克隆PCR產物測序并進行Blast比對分析，結果顯示，有2個為推定的轉錄因子，分別與MYB轉錄因子MYB11-like（NCBI登錄號：LOC125212678）和TGA轉錄因子TGA2.2-like（NCBI登錄號：LOC116027932）同源，其余大多為功能未知的蛋白，這2個轉錄因子（IbMYB11和IbTGA2.2）可能與IbHQT1啟動子存在潛在互作關系。

圖4 IbHQT1啟動子互作蛋白的篩選和鑒定Fig. 4 Screening and identification of IbHQT1 promoter interacting proteins

2.5 IbMYB11和IbTGA2.2與IbHQT1啟動子互作的鑒定

分別將IbMYB11-AD和IbTGA2.2-AD與pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體進行酵母單雜交互作驗證，結果顯示，所有共轉誘餌質粒和AD載體的酵母菌株在SD/-Trp-Leu培養基上均能正常生長；挑取SD/-Trp/-Leu培養基上的菌落至含75 mmol/L 3AT的SD/-Trp-Leu-His平板上，IbMYB11-AD/pHIS2-IbHQT1pro、IbTGA2.2-AD/pHIS2-IbHQT1pro和陽性對照克隆均可正常生長，而陰性對照則不能生長（圖4-B），表明IbMYB11和IbTGA2.2蛋白可以與IbHQT1啟動子發生互作。

2.6 IbMYB11、IbTGA2.2和IbHQT1基因共表達分析

為了解IbMYB11和IbTGA2.2與IbHQT1之間調控關系，根據已發表的轉錄組數據［25]，分析其共表達特征發現，它們在所檢測的甘薯嫩葉和嫩莖中高表達，在塊根中表達量相對較低（圖5-A）。利用CORREL函數進行相關性分析發現IbMYB11和IbTGA2.2與IbHQT1表達之間存在正相關，相關系數分別達到0.79和0.98（圖5-B）。進一步分析發現IbMYB11和IbTGA2.2的表達與甘薯中6種綠原酸及總綠原酸含量明顯正相關，相關系數均在0.75以上（圖5-B）。結果表明，IbMYB11和IbTGA2.2可能通過調控IbHQT1參與甘薯綠原酸的積累。

圖5 IbMYB11、IbTGA2.2和IbHQT1共表達（A）及其與甘薯綠原酸積累相關性（B）Fig. 5 Co-expression of IbMYB11, IbTGA2.2 and IbHQT1（A）and their correlations with chlorogenic acid accumulation in sweet potato（B）

3 討論

轉錄因子通過與下游靶基因啟動子結合進而激活或抑制靶基因的表達，在植物次生代謝生物合成過程中具有重要的調控作用［26-27]。IbHQT1是甘薯綠原酸生物合成的關鍵酶基因，挖掘鑒定IbHQT1上游轉錄調控因子對揭示甘薯綠原酸生物合成調控機制具有重要的意義。本研究分離獲得1500 bp的IbHQT1上游DNA序列，通過PlantCARE對IbHQT1啟動子區進行順式作用元件預測分析，結果顯示，IbHQT1啟動子區存在DOf、ERF、WRKY、MYB、MYC和TGA等多種轉錄因子結合位點，暗示IbHQT1的表達可能受到這些轉錄因子的調控；進一步利用酵母單雜交技術，以IbHQT1啟動子序列為誘餌，篩選出2個與IbHQT1啟動子區結合的轉錄因子IbMYB11和IbTGA2.2。

MYB轉錄因子在植物次生代謝物生物合成途徑中具有重要的調控作用，尤其是對苯丙素類代謝物的調控研究比較深入［28-29]。MYB基因家族中第S4、S5、S6和S7亞家族成員廣泛參與包括類黃酮、花青素和木質素在內的多種苯丙素類代謝物的生物合成［29-32]。本研究篩選到IbMYB11能夠與IbHQT1啟動子發生互作，IbMYB11屬于S7亞家族成員，擬南芥中S7亞家族成員AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111具有調控苯丙烷次生代謝產物黃酮醇生物合成的功能［33]。在番茄（Solanum lycopersicum）與煙草（Nicotiana tabacum）過表達擬南芥AtMYB11和AtMYB12均能促進綠原酸及黃酮醇的合成［34-35]。TGA轉錄因子是bZIP轉錄因子一個亞家族，能夠特異結合靶基因啟動子區的TGACG-motif，在植物生長發育、脅迫響應及次生代謝調控方面具有重要的功能［35]。目前，已證實TGA轉錄因子能夠調控天然橡膠、青蒿素、雷公藤甲素和生物堿等次生代謝物生物合成［36-39]，但其是否調控苯丙素類代謝物生物合成還未見報道。本研究發現IbTGA2.2能夠與IbHQT1啟動子發生互作，說明其可能參與甘薯綠原酸的生物合成調控。此外，IbMYB11、IbTGA2.2和IbHQT1在甘薯不同組織和發育階段具有類似的表達特征，且與甘薯綠原酸含量存在明顯的正相關。這些結果說明，IbMYB11和IbTGA2.2可能通過調控IbHQT1的表達參與甘薯綠原酸的生物合成的調控。轉錄因子在調控植物次生代謝時通常和其他轉錄共激活子或轉錄共抑制子形成復合體，例如，MYB通常與bHLH、WD40、ERF、NAC和WRKY等轉錄因子互作形成復合體協同調控代謝途徑中的多個基因的表達，在植物苯丙烷類代謝物積累中發揮著重要的調控作用［40-43]。接下來將深入研究IbMYB11和IbTGA2.2轉錄因子對IbHQT1轉錄的調控效應，并鑒定還有哪些轉錄因子協同參與，為揭示甘薯綠原酸積累機制奠定基礎。

4 結論

獲得2個與IbHQT1啟動子相結合的轉錄因子IbMYB11和IbTGA2.2，二者與IbHQT1具有類似的表達特征且與綠原酸積累正相關，可能通過調控IbHQT1的表達進而參與甘薯綠原酸的生物合成。