二套小麥-簇毛麥染色體附加系苗期耐鹽性及籽粒硒和葉酸的含量

韓志陽 賈子苗 梁秋菊 王軻 唐華麗 葉興國 張雙喜

（1. 寧夏大學農學院，銀川 750021；2. 中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081；3. 寧夏農林科學院農作物研究所，銀川 750101；4. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

小麥是我國主要的糧食作物之一，種植面積僅次于玉米和水稻［1]。新中國成立以來，小麥生產取得了長足進步，從1950年的660 kg/hm2到2012年的4487 kg/hm2，年均增產1.9%，總產量增加了6倍多［2]。但是由于過去對小麥產量的過度重視，導致目前小麥品質改良的研究進展相對緩慢。我國小麥品質改良主要集中在中筋和中強筋品種培育，籽粒蛋白質含量與歐美相當，但蛋白質品質不理想，導致加工品質較差［3-4]。另外，隨著灌溉農業的發展以及化肥、農藥的大量施用，小麥生產區土壤鹽漬化和土壤污染等問題頻發［5]，迫切需要培育高抗、優質的小麥新品種［6]。

長期以來，小麥的遺傳改良主要依賴于小麥種內遺傳變異和優良基因的隨機組合，可用基因資源的減少直接降低了小麥育種效率和突破性品種的持續培育［7]。將小麥近緣物種中蘊含的優良基因引入小麥，是突破當下小麥育種瓶頸的重要措施。研究表明，黑麥屬［8]、山羊草屬［9]、簇毛麥屬［10]、偃麥草屬［11]為小麥銹病和白粉病提供重要抗病基因。除了抗病性之外，小麥野生資源在長期的生存和競爭過程中對各種非生物脅迫也表現出較強的適應能力。黏果山羊草耐熱、抗旱和耐鹽性較強，粗山羊草耐極端寒冷的性能突出，冰草屬中的多數變種對干旱、寒冷和鹽堿環境具有適度的耐受性［12-13]。

在所有非生物脅迫中，鹽脅迫最為典型，對作物產量的影響最大。通過瞬間鹽脅迫和逐步鹽脅迫分別鑒定小麥-長穗偃麥草附加系和代換系耐鹽性，發現染色體3E、5E與瞬間鹽脅迫引起的耐受性相關，染色體3E、4E和5E則與逐步性鹽脅迫造成的耐受性相關［14]。單雷等［15]采用體細胞雜交的方式將小麥原生質體與高冰草原生質融合，培育了小麥體細胞雜交品種山融3號，該品種在鹽脅迫下產量比對照高22.58%。劉旭等［16]利用小麥與黑麥、延安賴草雜交，從回交后代中選育出小賴麥98-160、小黑麥98-113等6份強耐鹽材料。魏景芳等［17]對小麥與多枝賴草雜交后代進行不同生育期耐鹽性鑒定，培育出耐鹽性較為突出的新品系L88。目前小麥的耐鹽基因資源還很缺乏，對小麥近緣植物中耐鹽性的挖掘和利用還不夠，需要對更多小麥與其近緣種屬遠緣雜交中間材料進行耐鹽性鑒定。

另外，山羊草屬籽粒中含有與胚乳硬度有關的蛋白質，可以用于改良小麥的面包烘焙品質；小黑麥籽粒蛋白質含量高達20%，且Zn和Fe的含量較高［18-20]。硒和葉酸作為人體必須營養元素，與人類生命活動和健康息息相關，硒元素和葉酸缺乏會引起許多重大疾病的產生［21]。Fox等［22]和Hawkesford等［23]利用同位素對小麥、大蒜和魚類進行硒元素標記發現，硒在小麥、大蒜、魚類中的生物利用率分別為81%、78%和56%，因此小麥是提高人體硒元素利用的最佳選擇。但我國富硒小麥研究起步較晚，小麥籽粒硒含量總體較低。據鑒定，河北省120個小麥品種平均硒含量為7.00 μg/100 g［24]，四川省62個小麥品種平均硒含量為3.50 μg/100 g［25]。Riaz等［26]對我國360個小麥品種葉酸含量進行分析，認為基因型和環境條件對葉酸的積累有顯著影響，建議根據當地情況篩選葉酸含量較高的小麥品種作為育種親本。目前為止，還沒有對小麥與近緣種屬遠緣雜交中間材料進行硒元素和葉酸含量研究的報道。

簇毛麥作為栽培小麥的近緣物種，可以在惡劣潮濕的環境中生長，表現出植株長勢強、籽粒多、植株分蘗能力強等生長發育特點［27]，對條銹病、稈銹病、白粉病和條狀花葉病毒病［28]均表現出較強的抗性，還擁有耐鹽、耐寒、抗旱［29-30]等優良性狀，是小麥改良的重要基因資源。迄今為止，國際上共收集了300多份不同來源的簇毛麥種質資源，將多個簇毛麥優良基因引入小麥遺傳背景中［31-32]，創制了高抗白粉病的小麥-簇毛麥6AL·6V#2S和6DL·6V#4S等易位系，培育了農藝性狀優良的揚麥22、金禾1號、寧春66號等抗白粉病小麥新品種［33]，以及農藝性狀優良、高抗白粉病、再生能力和轉化能力強的Fielder改良系WT48和FL347等［34]，對小麥遺傳改良、產業發展、轉基因育種和功能基因組研究等具有重要作用。迄今為止，關于利用簇毛麥改良小麥的研究都集中在增強抗病性方面，很少涉及利用簇毛麥改良小麥抗鹽性和營養品質。

本研究擬以實驗室保存的2套小麥-簇毛麥附加系為材料，進行苗期耐鹽性鑒定，以及籽粒中硒元素、葉酸含量分析，明確簇毛麥相關染色體是否攜帶與耐鹽、硒元素含量和葉酸含量有關的基因，為進一步利用染色體工程和分子標記技術將簇毛麥中含有的這些優良基因導入小麥，改良小麥耐鹽性及提高小麥籽粒葉酸和硒含量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥-簇毛麥#2二體附加系DA（1-7）V#2由南京農業大學王秀娥教授提供，該套材料中的外源染色體來自簇毛麥#2；小麥-簇毛麥#3二體附加系DA（1-7）V#3為河南農業大學劉文軒教授提供，該套材料中的外源染色體來自簇毛麥#3。以上2套材料的遺傳背景均為中國春（CS）。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽鑒定 在超凈工作臺內，將小麥成熟種子用70%乙醇滅菌15 min，25%次氯酸鈉滅菌25 min，無菌水清洗4-5次；加入適量無菌水，4℃過夜，用25%次氯酸鈉滅菌15 min，無菌水沖洗后剝取成熟胚，胚芽朝上，接種在含有NaCl的培養基（1/2 MS+20 g/L蔗糖+2.4 g/L植物凝膠+200 mmol/L NaCl，pH 6.0）上，每個材料接種10個成熟胚，重復3次，共30個成熟胚，置于培養箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養3 d；在光照下培養5 d后統計鹽脅迫下各個小麥-簇毛麥附加系和對照材料的萌發率，30 d后統計幼苗存活率，測定成活幼苗的株高和根長。

1.2.2 硒含量測定 在裝有鋼球的離心管中放入2 g小麥成熟種子，在磨樣機充分上磨碎，每個材料取0.5 g粉末放入試管中，加入2 mL硝酸溶液，120℃消解30 min，加入去離子水至終體積為15 mL。采用電感耦合等離子體質譜儀測定參試材料的硒含量，計算公式為：樣品硒含量（μg/g）=（C×V×F）/M，其中，C表示樣品濃度，V表示樣品定容體積，F表示樣品稀釋倍數，M表示樣品質量。

1.2.3 葉酸提取和含量測定 每個小麥材料取20粒種子，研磨后，取50 mg粉末于1.5 mL離心管中，加入1 mL提取液（含NaH2PO418.96 mg、NaHPO4H2O 60.85 mg和抗壞血酸鈉0.5 g，混合過濾后加入200 μL β-巰基乙醇），混勻，先沸水浴10 min，再立即冰浴10 min。在遮光條件下加入大鼠血清30 μL，混勻后置于37℃烘箱中處理4 h，再次進行沸水浴10 min，冰浴10 min。然后4℃ 13000 r/min離心10 min，取400 μL上清液于新離心管中，4℃ 13000 r/min離心20 min。最后取90 μL底液加入到測樣管中，再加入10 μL甲氨蝶呤（methotrexate），進行葉酸含量測定。葉酸衍生物濃度依次記為C1、C2、C3...Cn，單位為ng/mL。樣品質量為M，單位為mg，葉酸含量計算公式為：F=F［（C1+C2+C3+C4+ ...Cn）/M]×100，單位為μg/100 g。

2 結果

2.1 鹽脅迫對小麥-簇毛麥附加系成熟胚萌發率的影響

將2套小麥-簇毛麥附加系的成熟胚接種在含有NaCl的培養基上，生長10 d后，對不同材料的萌發率進行統計（表1）。在鹽脅迫條件下，小麥-簇毛麥#2附加系成熟胚的萌發率為16.67%-43.33%，其中，DA5V#2的萌發率最高，其次是DA6V#2（33.33%），DA1V#2的萌發率最低，但小麥-簇毛麥#2附加系的萌發率均高于對照中國春（6.66%）；小麥-簇毛麥#3附加系的萌發率為26.67%-70.00%，其中，DA3V#3的萌發率最高，其次是DA7V#3（56.67%），DA5V#3最低（26.67%），均顯著高于中國春。相對而言，小麥-簇毛麥#2在鹽脅迫下的萌發率低于小麥-簇毛麥#3，小麥-簇毛麥#3附加系DA3V#3、DA7V#3和DA2V#3的萌發率均在50.00%以上，表現出較好的苗期耐鹽性。

表1 小麥-簇毛麥附加系成熟胚在鹽脅迫下的萌發情況Table 1 Germination situation of mature embryos of wheat- Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

2.2 鹽脅迫對小麥-簇毛麥附加系成熟胚幼苗生長狀況的影響

小麥-簇毛麥附加系成熟胚在含有NaCl的培養基上生長30 d后，測定各材料的存活株數、株高和根長。結果（表2）表明，2套小麥-簇毛麥附加系植株存活率均顯著高于對照中國春；小麥-簇毛麥#2二體附加系DA（1-7）V#2的平均株高為8.1-15.2 cm（表2，圖1-a），其中，DA4V#2的平均株高最高，DA4V#2、DA7V#2、DA3V#2和DA5V#2平均根長均大于對照中國春（8.6 cm）（表2和圖1-a）；小麥-簇毛麥#3二體附加系DA（1-7）V#3的平均株高為9.9-16.1 cm（表2和圖1-b），DA2V#3最大，DA5V#3最小，只有DA5V#3株高低于對照中國春（表2和圖1-b）；DA 2V#3平均根長最大，為3.4 cm。綜合2套小麥-簇毛麥附加系的鑒定結果，認為DA2V#3、DA4V#2表現出較好的苗期耐鹽性，可以作為小麥耐鹽育種的潛在資源。

圖1 小麥-簇毛麥附加系在鹽脅迫下的生長狀況Fig. 1 Growing status of wheat-Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

表2 小麥-簇毛麥附加系在鹽脅迫下的生長情況Table 2 Growth status of mature embryos of wheat- Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

2.3 不同小麥-簇毛麥附加系籽粒硒含量測定分析

7個小麥-簇毛麥#3附加系中，DV2#3的籽粒硒含量為7.60 μg/100 g，高于對照（7.54 μg/100 g），其他6個附加系籽粒硒含量均低于對照，其中，DV7#3最低（6.35 μg/100 g）。小麥-簇毛麥#2附加系籽粒硒含量為6.29-8.47 μg/100 g（圖2-a），其中，DV3#2和DV2#2（8.23 μg/100 g）高于對照，DV4#2最低（6.29 μg/100 g）。結果表明，導入簇毛麥染色體后總體上引起小麥籽粒硒含量降低，但附加系DV2#2和DV2#3高于對照中國春，認為簇毛麥2V染色體可能攜帶籽粒富含硒元素的相關基因。

圖2 小麥-簇毛麥附加系籽粒中硒含量的測定Fig. 2 Selenium content analysis in the grains of wheat-Dasypyrum villosun addition lines

2.4 不同小麥-簇毛麥附加系籽粒葉酸含量測定分析

通過測量籽粒葉酸，小麥-簇毛麥附加系#2附加系中，DA6V#2籽粒葉酸含量最高，為26.10 μg/100 g，其次是DA4V#2（20.23 μg/100 g），均顯著高于對照中國春（10.98 μg/100 g）；DA7V#2葉酸含量為9.00 μg/100 g，低于中國春（圖3-a）。小麥-簇毛麥附加系#3附加系中，DA5V#3最高（16.08 μg/100 g），其次是DA1V#3（14.02 μg/100 g），均高于對照中國春（10.98 μg/100 g），DA3V#3最低（圖3-b）。與小麥-簇毛麥#2附加系相比，小麥-簇毛麥#3附加系葉酸含量變化范圍較小。差異顯著性分析發現，小麥-簇毛麥附加系DA4V#2、DA6V#2葉酸含量與對照中國春的差異達極顯著水平，DA3V#2、DA5V#2、DA5V#3與中國春的差異達顯著水平。總之，小麥-簇毛麥#3附加系籽粒中的葉酸含量低于小麥-簇毛麥#2附加系，DA6V#2附加系的葉酸含量最高，推測6V#2染色體可能攜帶促進籽粒葉酸合成的相關基因。

圖3 小麥-簇毛麥附加系籽粒中葉酸含量測定結果Fig. 3 Folic acid content results in the grains of wheat-Dasypyrum villosun addition lines

3 討論

我國鹽堿地分布范圍廣泛，對小麥生產影響較大，需要篩選耐鹽性小麥種質資源，培育耐鹽性強的小麥品種［35]。由于小麥的耐鹽性在成熟期鑒定需要很長時間，因此鑒定小麥耐鹽性的研究主要集中在芽期和苗期。趙旭等［36]對4個冬小麥品種進行耐鹽性鑒定發現，小麥種子萌發的臨界鹽濃度為150-200 mmol/L。彭志等［37]、王萌萌等［38]分別對多個小麥品種進行了室內耐鹽性鑒定，篩選出一些萌發期耐鹽性較好的品種。本研究首次利用成熟胚離體培養對2套小麥-簇毛麥附加系材料進行了萌發期和苗期耐鹽性鑒定，與其他鑒定方法相比，組織培養鑒定方式確保一致的環境條件。結果表明，在小麥的遺傳背景中引入簇毛麥染色體后，萌芽期對鹽脅迫的耐性增強，附加系萌發率均高于對照中國春，尤其DA5V#2、DA3V#3、DA7V#3和DA2V#3等附加系耐鹽能力較強，初步認為簇毛麥5V#2、3V#3和2V#3染色體上可能存在耐鹽相關基因。

目前對籽粒中硒元素含量的研究和富硒小麥資源的鑒定較少。劉慧等［39]對655個小麥品種的硒元素含量進行檢測發現，平均含量為6.46 μg/100 g，春小麥和冬小麥平均硒含量分別為6.75和 6.42 μg/100 g，不同年份間春小麥和冬小麥差異較大。Lyons等［40]對同一小麥品種連續3年進行檢測發現，不同年份硒元素含量不同，差異較為明顯，可能是因為水分、土壤、光照等環境條件對小麥籽粒中硒元素含量有影響。此外發現，外源施用無機硒鹽也能引起小麥硒元素含量的變化［41]。迄今為止，我國依然缺乏富硒小麥品種，需要從小麥近緣種屬中挖掘富硒基因資源，促進富硒小麥品種培育。本研究對14個小麥-簇毛麥附加系分別進行籽粒硒含量測定發現，附加系DA2V#2、DA2V#3和DA1V#2籽粒中硒含量顯著高于對照中國春，推測簇毛麥2V染色體可能攜帶與籽粒硒元素積累的相關基因。

小麥籽粒中葉酸含量主要受到基因型的影響。Riaz等［26]對360個小麥品種籽粒中的葉酸含量進行檢測后發現，冬小麥和春小麥葉酸含量具有差異，平均含量分別為36.08和43.98 μg/100 g，并且篩選出幾個葉酸含量較高的小麥基因型。小麥籽粒中葉酸含量還受到其他因素的影響，其中，貯藏和加工對小麥籽粒葉酸含量的影響較大。中國農業科學院作物科學研究所轉基因中心小麥實驗室詳細研究了小麥籽粒和面粉儲藏不同時間，以及面粉不同加工方式（包括面包、饅頭、面條）對葉酸含量的影響。結果表明，存貯2個月時面粉中的葉酸含量即出現下降，存貯6個月時葉酸損失率平均為28%；葉酸在籽粒中較為穩定，存貯4個月時葉酸含量開始出現下降，存貯6個月時葉酸損失率平均為17%；存貯8個月時面粉和籽粒中葉酸含量均顯著下降，分別為30%和26%；在煮后面條、蒸后饅頭和烘焙后面包中葉酸含量分別為1.93-2.29 μg/100 g FW（鮮重）、12.53-19.80和30.01-45.92 μg/100 g FW，分別為面粉中葉酸含量的22%、158%和391%。認為饅頭和面包可優先作為葉酸攝入來源，其葉酸含量比面粉中提高了1.5-4.0倍。小麥貯藏和加工雖然導致一定程度的葉酸損失，但仍然有較多的葉酸存在，沒有導致存在葉酸的降解［42]。另外，利用轉基因技術可以提高小麥籽粒中的葉酸含量。通過農桿菌介導的轉基因技術，將大豆、番茄中的葉酸合成相關基因GmGCHI、GmADCS和LeADCS轉入小麥，轉基因小麥籽粒中的葉酸含量比野生型對照提高了2.3-5.6倍［43]。本研究發現，小麥-簇毛麥附加系6V#2籽粒中葉酸含量的增加最為明顯，認為簇毛麥6V#2染色體上可能攜帶影響葉酸合成的相關基因。

本研究鑒定到簇毛麥5V#2、3V#3和2V#3染色體可能攜帶耐鹽相關基因，2V染色體可能攜帶與籽粒硒元素積累的相關基因，6V#2染色體可能攜帶籽粒葉酸合成的相關基因。簇毛麥在全世界有300多種，因為它們起源的地理環境和生態環境的不同，不同來源的簇毛麥在基因組成上存在著多樣性和遺傳歧化。如對小麥白粉病的抗性，并不是所有簇毛麥都具有抗病基因，其中，簇毛麥#2和#4抗白粉病，簇毛麥#5就不抗白粉病。所以，簇毛麥#2和#3在耐鹽及硒和葉酸含量等遺傳控制面也會存在差異［44-45]。本研究鑒定的可能與改良小麥耐鹽及籽粒硒和葉酸含量相關的簇毛麥染色體以附加系形式存在于小麥遺傳背景中，難以直接用于小麥育種和生產，需要進一步培育攜帶目標基因染色體的代換系和染色體片段的易位系。染色體特異的分子標記可以加速小麥-簇毛麥染色體代換系和易位系的選育。Li等［45]利用轉錄組測序技術開發了全套鑒定簇毛麥不同染色體臂的特異分子標記，并選育了部分小麥-簇毛麥染色體代換系和易位系，為下一步將簇毛麥不同染色體上攜帶的耐鹽、籽粒硒元素積累和葉酸合成的相關基因以易位系方式導入小麥奠定基礎。

4 結論

附加系DA5V#2、DA3V#3和DA2V#3在鹽脅迫下萌發、存活和生長狀況較好，DA2V#3和DA2V#2平均硒含量較高，DA6V#2平均葉酸含量較高。簇毛麥5V#2、3V#3和2V#3染色體可能存在耐鹽相關基因，簇毛麥2V染色體可能存在籽粒富硒相關基因，6V#2染色體可能攜帶籽粒葉酸合成的相關基因。