YFV17D非感染性報(bào)告復(fù)制子及假病毒包裝系統(tǒng)的建立

何宇航 胡濤 吳震，3 賀煜，3 程安春，3 陳舜，3

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130 ；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3. 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

黃熱病毒（yellow fever virus, YFV）屬于黃病毒科（Flavivirdae）黃病毒屬（Flavivirus），該類屬成員還包括昆津病毒（Kunjin virus, KUNV）、坦布蘇病毒（Tembusu virus, TMUV）、登革熱病毒（Dengue virus, DENV）和日本腦炎病毒等。與其他黃病毒屬成員一樣，YFV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)11 kb左右，擁有一個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）。ORF編碼一個(gè)多聚蛋白，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白（capsid protein, C protein）、前膜蛋白（premembrane, prM protein）和囊膜蛋白（envelope protein, E protein），以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein）： NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。在ORF兩側(cè)為兩個(gè)高度結(jié)構(gòu)化的非編碼區(qū)（untranslated region, UTR）5' UTR 和3' UTR，包含病毒RNA合成以及影響病毒翻譯和復(fù)制所必要的順式作用元件［1]。YFV有兩種野生毒株，包括Asibi毒株和法國(guó)噬內(nèi)臟病毒，其中YFV17D是由 Asibi毒株在猴子、小鼠和雞細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行了 176 次傳代而來(lái)，其保留了病毒的免疫原性，失去了噬內(nèi)臟性、噬神經(jīng)性毒性和在蚊子體內(nèi)傳播能力［2-4]。

亞基因復(fù)制子系統(tǒng)作為反向遺傳學(xué)的重要組成部分，與感染性克隆一樣能作為研究病毒強(qiáng)有力的工具。黃病毒亞基因復(fù)制子是保留了全部的非結(jié)構(gòu)蛋白和非編碼區(qū)的順式作用元件，刪除了部分結(jié)構(gòu)蛋白基因的一種缺陷型基因組，它能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自行完成翻譯和復(fù)制［5]。將報(bào)告基因引入以代替缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因區(qū)域，并通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，可以更加容易監(jiān)測(cè)亞基因復(fù)制子在細(xì)胞中的復(fù)制情況［6-8]。在復(fù)制子基礎(chǔ)上，通過(guò)攜帶編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM、E）的重組質(zhì)粒來(lái)提供缺失的結(jié)構(gòu)蛋白，與可以自我復(fù)制的病毒亞基因組產(chǎn)生打包復(fù)制子基因組的假病毒顆粒，其在結(jié)構(gòu)上近似于野生型病毒，具有與野生病毒相似的進(jìn)入、翻譯和復(fù)制的過(guò)程［9-11]。但由于這種病毒樣顆粒所包含的基因仍然缺乏必需的結(jié)構(gòu)蛋白基因，無(wú)法再次包裝成成熟的病毒顆粒，故而這種病毒樣顆粒無(wú)法從宿主細(xì)胞中釋放啟動(dòng)新一輪的感染，因此稱之為單輪感染病毒顆粒（single round infectious virus particles, SRIPs）［12]。這種通過(guò)反式包裝出的SRIPs已經(jīng)在TMUV、DENV、KUNV和寨卡病毒上實(shí)現(xiàn)應(yīng)用［13-16]。

本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功分別構(gòu)建攜帶3種不同報(bào)告基因（Nluc、oxGFP和mCherry）的YFV17D復(fù)制子。通過(guò)檢測(cè)Nluc螢光素酶蛋白、oxGFP和mCherry熒光蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和對(duì)病毒雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）染色觀察，監(jiān)控YFV17D復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中翻譯和復(fù)制。將表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的包裝質(zhì)粒（pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME）與復(fù)制子共同轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，收集上清再次感染BHK-21細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Nluc活性和oxGFP、mCherry蛋白表達(dá)來(lái)監(jiān)控SRIPs 的產(chǎn)生而成功建立YFV17D的假病毒包裝系統(tǒng)。構(gòu)建攜帶報(bào)告基因的YFV17D復(fù)制子，可以幫助深入了解YFV基因組翻譯和復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，基于復(fù)制子的 SRIPs系統(tǒng)為研究病毒吸附、進(jìn)入和組裝，以及病毒與宿主相互作用提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21由本實(shí)驗(yàn)室保存、攜帶報(bào)告基因的單拷貝pCC1-YFV17D-rep復(fù)制子質(zhì)粒（愛(ài)沙尼亞塔爾圖大學(xué)Andrews Merits教授惠贈(zèng)）、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、Sure菌株、低拷貝質(zhì)粒pACYC177和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1均由本實(shí)驗(yàn)室保存；高保真 KOD OneTMPCR Master Mix購(gòu)于東洋紡生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于NEB公司；同源重組酶購(gòu)于莫納生物科技有限公司；核酸脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于翌圣生物科技股份有限公司；NanoLuc螢光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司；鼠抗dsRNA J2 抗體購(gòu)于SCICONS公司；FITC熒光和TRITC熒光標(biāo)記羊抗鼠lgG購(gòu)于Abcam公司；DAPI購(gòu)于北京酷來(lái)搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 報(bào)告復(fù)制子和包裝質(zhì)粒構(gòu)建 使用重疊延伸PCR技術(shù)和同源重組策略來(lái)構(gòu)建YFV17D報(bào)告復(fù)制子。在pACYC177載體中選擇2個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SgrA I和BstE II，在YFV17D復(fù)制子基因組中選擇Kpn I、Nhe I和Xho I 3個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用于之后的酶切連接。使用TMUV感染性克隆質(zhì)粒pACNR CQW1-intron擴(kuò)增巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）啟動(dòng)子、丁型肝炎核酶（Hepatitis D ribozyme, HDVr）和猴空泡病毒40（Simian virus 40, SV40）多聚腺苷酸（polyadenylation, poly）尾信號(hào)序列。將CMV與“5' UTR-Kpn I”片段融合成P1片段，其中P1片段覆蓋“SgrAI-CMV-5' UTR -Kpn I”之間的基因序列；片段P2覆蓋“Kpn I-Nhe I”之間的基因序列；片段P3覆蓋“Nhe I-Xho I”之間的基因序列；將HDVr和SV40 poly（A）與“Xho I-3' UTR”融合成完整P4片段，覆蓋“Xho I-BstE II”之間的基因序列。接著，將P1片段與線性化的pACYC177載體同源重組，形成P1片段的亞克隆質(zhì)粒pACYC-P1，隨后利用Kpn I、Nhe I和Xho I限制性內(nèi)切酶將P1-P4全部片段按順序連接在pACYC177載體上，最終完成帶有3種不同報(bào)告基因的YFV17D復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建，分別命名為：pACYC-YFV17D-Nluc-rep、pACYC-YFV17D-mCherry-rep和 pACYC-YFV17D-oxGFP-rep以及pACYC-YFV17D-Nluc-rep-ΔGDD、pACYC-YFV17D-mCherry-rep-GDD-AAA和 pACYCYFV17D-oxGFP-rep-GDD-AAA。

包裝質(zhì)粒 pcDNA3.1-CprME質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。pcDNA3.1-C28prME以pcDNA3.1-CprME質(zhì)粒為模板，保留 C蛋白末端28個(gè)氨基酸，擴(kuò)增C28prME基因，與經(jīng)過(guò)Hind III和ApI I限制性內(nèi)切酶酶切后的pCDNA3.1（+）線性載體連接。

1.2.2 報(bào)告復(fù)制子和包裝系統(tǒng)的工作驗(yàn)證 將BHK-21細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞達(dá)到70%-90%匯合度時(shí)，按照翌圣核酸脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染YFV17D報(bào)告復(fù)制子，轉(zhuǎn)染6 h后更換含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，然后在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

YFV17D報(bào)告復(fù)制子和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至接種BHK-21細(xì)胞的6孔板中，轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清。將BHK-21細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%左右密度，棄去培養(yǎng)基，將收集的上清滴加至每孔中，孵育48 h后檢測(cè)。

1.2.3 NanoLuc螢光素酶活性的檢測(cè) 使用NanoLuc螢光素酶檢測(cè)試劑盒，收集轉(zhuǎn)染YFV17D-Nanolucrep后不同時(shí)間點(diǎn)的BHK-21細(xì)胞和孵育含SRIPs上清的BHK-21細(xì)胞。使用Glo Lysis Buffer裂解BHK-21細(xì)胞，添加至96孔板中，Nano-Glo底物和Nano-Glo assay buffer按1∶49比例混合獲得Nano Glo反應(yīng)物，與96孔板中細(xì)胞裂解樣品混合，在微孔板發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)樣品。

1.2.4 熒光蛋白的檢測(cè) 從24孔板中收集轉(zhuǎn)染YFV17D-oxGFP-rep、YFV17D-mCherry-rep后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞爬片和孵育含SRIPs上清的BHK-21細(xì)胞爬片。收集的爬片使用4%多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌后，使用0.25%Triton-PBS 在4℃透化1 h，PBST洗滌；細(xì)胞核經(jīng)DAPI復(fù)染；最后滴加甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay, IFA） 從24孔板中收集轉(zhuǎn)染3種報(bào)告復(fù)制子質(zhì)粒的不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞爬片。爬片使用4%多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌后，使用 0.25% Triton-PBS 在4℃透化1 h，PBST洗滌；加入5% BSA在37℃封閉1 h，使用PBST洗滌；用鼠抗dsRNA J2 抗體作為一抗，分別以FITC熒光標(biāo)記羊抗鼠lgG和TRITC熒光標(biāo)記羊抗鼠lgG作為二抗孵育，細(xì)胞核使用DAPI復(fù)染；最后滴加甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 YFV17D報(bào)告復(fù)制子的構(gòu)建

以分別攜帶NanoLuc、mCherry、oxGFP報(bào)告基因的YFV17D復(fù)制子pCC1-YFV17D-rep為模板。在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有質(zhì)粒pACYC177的基礎(chǔ)上，通過(guò)SgrA II和BstE II限制性內(nèi)切酶酶切，獲得pACYC177線性載體。CMV啟動(dòng)子、HDVr和SV40 poly（A）序列由本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的TMUV感染性克隆質(zhì)粒pACNR CQW1-intron上擴(kuò)增。以pCC1-YFV17D-rep為模板，擴(kuò)增覆蓋YFV17D復(fù)制子全部亞基因組的4個(gè)片段，分別命名為P1、P2、P3 和P4。利用同源重組酶將4個(gè)亞基因片段與pACYC177線性載體連接，獲得完整的YFV17D復(fù)制子質(zhì)粒。由CMV驅(qū)動(dòng)的基因組可以在細(xì)胞內(nèi)直接起始轉(zhuǎn)錄，基因組下游添加的HDVr切割轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生真實(shí)的3' 末端［17]，同時(shí)，SV40 poly（A）的添加提供了轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)［18]。為了證明報(bào)告基因的表達(dá)是由于亞基因復(fù)制子復(fù)制和翻譯的結(jié)果，將YFV17D NS5基因進(jìn)行突變，將RNA 依賴的 RNA 聚合酶結(jié)構(gòu)域的 GDD 基序缺失（ΔGDD）或突變成丙氨酸（GDD-AAA）（圖1），構(gòu)建具有復(fù)制缺陷的YFV17D復(fù)制子，作為陰性對(duì)照。

2.2 YFV17D報(bào)告復(fù)制子特性的驗(yàn)證

將復(fù)制子質(zhì)粒YFV17D-Nluc-rep和YF17D-Nlucrep-ΔGDD轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，分別在轉(zhuǎn)染后的4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h收集細(xì)胞樣，并檢測(cè)Nluc螢光素酶活性。從轉(zhuǎn)染后的4-48 h，野生型復(fù)制子的Nluc螢光素酶活性持續(xù)增加，并且在48 h到達(dá)最大值；而復(fù)制缺陷型復(fù)制子在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，從24-72 h螢光素酶活性逐漸下降。比較野生型復(fù)制子和復(fù)制缺陷型復(fù)制子Nluc表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后的48-72 h，兩者Nluc水平表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（圖2-A）。以上表明，完成首輪翻譯后，缺陷型復(fù)制子不能再持續(xù)表達(dá)Nluc；而野生型復(fù)制子在轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后螢光素酶活性在持續(xù)增加，說(shuō)明野生型復(fù)制子能夠正常復(fù)制，Nluc的表達(dá)增加是依賴復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制而增加的。

圖2 YFV17D報(bào)告復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中的熒光蛋白表達(dá)Fig. 2 Fluorescent protein expression of the YFV17D reporter replicon in BHK-21 cells

轉(zhuǎn)染攜帶mCherry和oxGFP熒光蛋白的YFV17D復(fù)制子至BHK-21細(xì)胞后，從轉(zhuǎn)染后36-72 h，野生型復(fù)制子中的紅色和綠色熒光持續(xù)增加，而復(fù)制缺陷型復(fù)制子沒(méi)有可見(jiàn)熒光出現(xiàn)，兩者之間呈現(xiàn)明顯的差異（圖2-B），這同樣說(shuō)明，熒光蛋白的持續(xù)表達(dá)需要復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制。以上通過(guò)對(duì)不同的熒光蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，我們所構(gòu)建的YFV17D報(bào)告復(fù)制子能夠在BHK-21細(xì)胞內(nèi)正常地完成翻譯和復(fù)制。

2.3 YFV17D復(fù)制子dsRNA的檢測(cè)

被黃病毒感染的細(xì)胞中能檢測(cè)到3種重要的RNA，包括病毒粒子RNA、雙鏈RNA和復(fù)制中間體RNA［19]。在黃病毒基因組復(fù)制過(guò)程中，是以病毒正鏈RNA基因組為模板復(fù)制產(chǎn)生互補(bǔ)的負(fù)鏈RNA，再以合成的負(fù)鏈RNA為模板合成大量正鏈RNA［20]。由于負(fù)鏈RNA在整個(gè)病毒基因組復(fù)制過(guò)程中僅作為復(fù)制正鏈基因組的模板，且多存在于雙鏈RNA的復(fù)制型和部分雙鏈的復(fù)制中間體中，所以通過(guò)對(duì)dsRNA染色，可以進(jìn)一步驗(yàn)證YFV17D復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。將3種YFV17D報(bào)告復(fù)制子分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，3種野生型報(bào)告復(fù)制子產(chǎn)生的dsRNA也逐漸增加，這說(shuō)明復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制。相反，NS5突變的復(fù)制缺陷型復(fù)制子由于RNA依賴的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)的缺陷，使RNA的復(fù)制受損，無(wú)法觀察到 dsRNA的產(chǎn)生（圖3-A-C）。以上結(jié)果說(shuō)明，本研究構(gòu)建的YFV17D報(bào)告復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中具有完成自身復(fù)制的能力。

圖3 YFV17D復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中的RNA復(fù)制情況Fig. 3 RNA replication of YFV17D replicon in BHK-21 cells

2.4 YFV17D SRIPs的產(chǎn)生和驗(yàn)證

由于復(fù)制子基因組中除了包含能夠?qū)崿F(xiàn)自身翻譯和復(fù)制所需的基因元件外，缺失了大部分結(jié)構(gòu)蛋白基因，而這些基因的缺失使復(fù)制子不能自主包裝成具有感染能力的病毒顆粒。我們構(gòu)建了表達(dá)缺失YFV17D結(jié)構(gòu)蛋白的兩種包裝質(zhì)粒pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME（圖4-A），并和YFV17D報(bào)告復(fù)制子質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，其中將只轉(zhuǎn)染報(bào)告復(fù)制子而不轉(zhuǎn)染包裝質(zhì)粒設(shè)置為對(duì)照組。在轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞上清，并再次感染BHK-21細(xì)胞，在上清孵育48 h以后檢測(cè)相應(yīng)熒光蛋白的表達(dá)水平（圖4-B）。結(jié)果顯示，兩種包裝質(zhì)粒pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME均可有效打包YFV17D-Nluc-rep復(fù)制子RNA，表現(xiàn)為熒光素酶活性顯著高于對(duì)照組（圖4-C）；同時(shí)，兩種包裝質(zhì)粒pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME均可有效打包YFV17D-oxGFP-rep和YFV17D-mCherry-rep復(fù)制子RNA，表現(xiàn)為對(duì)以IFA檢測(cè)到第二輪感染細(xì)胞中的綠色和紅色熒光蛋白表達(dá)（圖4-D）。以上結(jié)果表明，在共轉(zhuǎn)染體系中，由包裝質(zhì)粒提供的prM和E兩種結(jié)構(gòu)蛋白可打包亞基因組YFV17D復(fù)制子RNA，形成具有單輪感染能力的病毒樣顆粒釋放到上清。

圖4 YFV17D包裝系統(tǒng)的建立Fig. 4 Establishment of the YFV17D packaging system

3 討論

本研究以改造單拷貝質(zhì)粒pCC1-YFV17D-rep為起點(diǎn)，旨在避免該復(fù)制子質(zhì)粒以原核啟動(dòng)子SP6驅(qū)動(dòng)起始轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染繁瑣的操作。在設(shè)計(jì)上，我們使用CMV真核啟動(dòng)子替代原核啟動(dòng)子SP6，其能直接將基因組以DNA形式轉(zhuǎn)染至細(xì)胞并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄翻譯。黃病毒cDNA在大腸桿菌宿主中極不穩(wěn)定，潛在的原核啟動(dòng)子使基因組產(chǎn)生針對(duì)大腸桿菌的毒性蛋白，使其很難在大腸桿菌中穩(wěn)定傳代［21]。針對(duì)這樣的原核毒性，已經(jīng)有設(shè)計(jì)多種策略來(lái)應(yīng)對(duì)，包括使用極低拷貝數(shù)質(zhì)粒、多片段系統(tǒng)、體外連接方法、插入內(nèi)含子以及用于質(zhì)粒繁殖的酵母作為替代宿主菌［22-28]。原有的單拷貝質(zhì)粒載體pCC1雖然能極大程度減少原核毒性，但是由于質(zhì)?？截悢?shù)過(guò)低，使獲取足量的質(zhì)粒用于下游實(shí)驗(yàn)成為問(wèn)題。因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室在構(gòu)建TMUV復(fù)制子以及感染性克隆［8,29]的前期經(jīng)驗(yàn)，我們選用低拷貝質(zhì)粒作為載體，既能穩(wěn)定YFV17D基因組，又能得到一定量的質(zhì)?？截悢?shù)完成下游實(shí)驗(yàn)。

在構(gòu)建YFV17D復(fù)制子的策略上，我們保留了完整的C蛋白和全部非結(jié)構(gòu)蛋白，刪除了prM蛋白和E蛋白的絕大部分。此外，E基因的C端序列保留了34個(gè)氨基酸，用于編碼下游NS1蛋白的信號(hào)序列，信號(hào)序列的保留能保證NS1蛋白的正確加工以及非結(jié)構(gòu)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的正確轉(zhuǎn)運(yùn)［6,30]。此外，構(gòu)建表達(dá)缺失的結(jié)構(gòu)蛋白（prM和E）的質(zhì)粒作為包裝質(zhì)粒（pcDNA3.1-CprME和pcDNA3.1-C28prME）以包裝目的復(fù)制子，其中，pcDNA3.1-C28prME保留C蛋白的C端28個(gè)密碼子（C28），作為 prM 蛋白易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的信號(hào)序列； pcDNA3.1-CprME表達(dá)YFV17D的全部結(jié)構(gòu)蛋白。雖然，我們?cè)O(shè)計(jì)的兩種包裝質(zhì)粒都成功打包了復(fù)制子基因組，但是兩種包裝質(zhì)粒呈現(xiàn)出不同的包裝效率。從結(jié)果來(lái)看，無(wú)論是檢測(cè)Nluc活性，還是檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)，CprME包裝效率都明顯高于C28prME。Roby等［31]構(gòu)建的KUNV亞基因復(fù)制子刪除了KUNV C蛋白第18-100位密碼子，保留了完整的prM、E蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，并在同一質(zhì)粒中使用兩個(gè)CMV啟動(dòng)子分別表達(dá)KUNV的完整C蛋白和復(fù)制子亞基因組。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠產(chǎn)生低水平的SRIPs。但通過(guò)使用EF1α啟動(dòng)子替換驅(qū)動(dòng)C蛋白的CMV啟動(dòng)子時(shí)，不僅能表達(dá)出更高水平的C蛋白，而且同時(shí)還能顯著提高SRIPs的產(chǎn)生［32]。這解釋了不同包裝質(zhì)粒對(duì)YFV17D不同的包裝效率。在共轉(zhuǎn)染體系中，在YFV17D復(fù)制子基因組表達(dá)完整C蛋白的同時(shí)，包裝質(zhì)粒CprME比C28prME能額外提供完整C蛋白，使整個(gè)體系的C蛋白表達(dá)的量增加，更多的C蛋白與prM蛋白能更多地打包復(fù)制子基因組，從而提高包裝效率。

4 結(jié)論

本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建攜帶報(bào)告基因的YFV17D復(fù)制子，通過(guò)與表達(dá)YFV17D結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，成功包裝出具有單輪感染能力的假病毒顆粒。