氧化應激對骨髓間充質干細胞影響機制的研究進展*

俞衛娟,高靜媛 綜述,馮林杰,田發明 審校

(1.華北理工大學附屬醫院全科醫學科,河北唐山 063000;2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第982醫院創傷科,河北唐山 063000;3.華北理工大學公共衛生學院,河北唐山 063000)

骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一種來源于骨髓的細胞,具有多向分化能力,可向骨、軟骨、肌、成脂等譜系進行細胞分化[1-2]。BMSCs來源可靠,易于從骨髓中分離和擴增,便于獲得免疫原性,是組織工程領域理想的種子細胞[3-4]。在多種組織損傷的動物模型中,BMSCs均顯示出修復和重建受損組織更快、更好的再生能力,已廣泛用于多種疾病的治療,例如聯合基因治療腫瘤、脊髓損傷移植、自身免疫性疾病、神經系統相關疾病等,同時更是骨組織工程相關領域中的種子細胞[5-6]。骨穩態的維持取決于成骨譜系細胞和破骨譜系細胞之間的協調代謝活動,可使骨形成和骨吸收處于一種動態平衡[7-8]。當骨穩態失衡時,便會產生成骨不全癥、骨質疏松癥、骨折延遲愈合等代謝性骨病[9-10]。其中基本多細胞單位(basic multicelluler unit,BMU)作為調控骨穩態的細胞群,包括不同分化時期的成骨譜系細胞和破骨譜系細胞,而BMSCs作為成骨譜系細胞中的起源細胞,在上述疾病發生、發展中發揮了更為重要的作用[11-12]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)在病理狀態下誘導機體產生氧化應激反應,導致細胞內代謝紊亂,損傷蛋白質、脂質、DNA,使BMSCs增殖、分化受到抑制,凋亡增加,引起骨形成下降,致使骨代謝異常,骨穩態失衡[13-15]。本文通過匯總近年發表相關文獻,針對氧化應激對BMSCs功能的影響及相關機制予以簡要綜述,有助于為骨代謝疾病提供潛在的治療新思路。

1 氧化應激

氧化應激是指有機體在受到強烈的熱刺激、機械刺激、化學刺激等有害刺激時,引起ROS產生過多,使體內抗氧化系統的防御和修復系統功能出現超負荷,導致氧化-抗氧化系統失去平衡,同時機體更傾向于氧化狀態,進而對機體產生的一系列病理性氧化損傷[16]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是由氧化應激產生的氧化產物,可以作為過氧化指標,反映細胞氧化損傷程度的標志。抗氧化酶包括谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、血紅素加氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)等,具有清除自由基的能力,發揮抗氧化功能。

低水平的ROS可作為細胞內生理信號分子,為細胞傳遞信息,調控細胞的增殖與分化。而異常高水平的ROS則會增加線粒體膜通透性、線粒體腫脹、線粒體DNA損傷。這導致線粒體電子傳遞鏈功能障礙、三羧酸循環紊亂、ATP合成紊亂、跨膜電位降低、細胞色素C釋放、凋亡因子激活、依賴性凋亡通路形成,抑制BMSCs的增殖與分化,最終誘導BMSCs凋亡[17]。氧化應激反應引起BMSCs內DNA、脂質過氧化及信號傳導、轉錄的改變,以及基因表達變化從而使增殖能力降低,抑制分化,促進細胞凋亡[18-19]。研究發現,氧化應激通過調控相關細胞信號通路,影響內核基因的表達,抑制BMSCs的增殖、分化,誘導細胞凋亡,導致骨形成下降、骨量丟失和微觀結構退變,進而出現一系列骨代謝疾病[20]。

2 ROS對BMSCs功能的影響

2.1 對細胞增殖的影響

研究表明,低濃度過氧化氫預處理BMSCs可明顯上調SOD和CAT水平,以增強抗氧化損傷能力,促進BMSCs增殖,減少細胞凋亡[21]。缺氧常可引起氧化應激,而當缺氧因子基因被沉默后,ROS水平下降,細胞內Ca2+和NO水平升高,BMSCs存活率上升,促進細胞增殖和遷移[22]。

相關研究表明,氧化應激可能通過抑制Nrf2/HO-1通路抑制BMSCs的增殖能力,降低細胞活性[23-24]。正常生理情況下,細胞質中的核因子NF-E2相關因子(nuclear-factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作為關鍵的抗氧化應激因子與Kelch樣ECH關聯蛋白1(Kelch-1ike ECH- associated protein l,Keap1)蛋白結合并以非活性的狀態存在于細胞質中,其通過靶向蛋白酶降解從而保持Nrf2的低轉錄活性。在氧化應激條件下,機體的防御機制開啟,Nrf2-Keap1的相互作用以劑量依賴的方式進行解離,Nrf2與Keap1解離后從細胞質中轉移到細胞核,與細胞中防御相關的因子抗氧化反應元件(antioxidant-response element,ARE)結合,調節抗氧化蛋白,使HO-1等抗氧化酶表達增多,緩解氧化應激對細胞的損傷程度,逆轉氧化應激對BMSCs增殖的負性作用[25-27]。HO-1是一種催化血紅素降解的誘導酶,具有抗炎、抗氧化應激和抗凋亡特性。新的證據顯示,HO-1在維持骨穩態中至關重要,這使得HO-1成為骨質疏松治療的潛在靶點[28]。既往研究結果表明,異補骨脂素(isopsoralen,IPRN)可以通過抑制氧化應激和細胞凋亡來減少卵巢切除術(OVX)誘導的小鼠骨質流失,并促進HO-1誘導BMSCs的成骨分化,有望作為雌激素替代劑和天然抗氧化劑用于絕經后骨質疏松的治療[29]。CORM-3是一種攜帶一氧化物并復制其生物作用的新型化合物,在低劑量時是無毒、安全且現成的CO替代品,能改善OVX大鼠模型中的HO-1及其產物CO明顯降低的影響,從而延緩OVX大鼠體內的骨丟失[30]。同時,該研究的體外實驗表明,補充外源性CO通過激活Nrf2/HO-1信號通路逆轉過氧化氫誘導的線粒體功能障礙,通過調節巨噬細胞極化抑制破骨細胞分化。該研究揭示了低劑量CO在骨質疏松癥治療中的作用機制和應用潛力。

此外,激活Nrf2的重要上游調控因子磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)也可以降低氧化應激對BMSCs的不利影響,增強其增殖、遷移能力[31]。由于PI3K/AKT通路在細胞代謝中的關鍵作用,包括葡萄糖攝取、糖酵解、脂質合成、核苷酸合成和蛋白質合成,對于BMSCs的增殖功能至關重要。研究表明,通過激活PI3K/AKT/Nrf2或PTEN/PI3K/AKT信號通路,可以保護BMSCs免受氧化應激的氧化損傷。硒代L-甲硫氨酸是一種ROS清除劑,可以將過氧亞硝酸鹽還原為L-甲硫氨酸硒氧化物,然后通過谷胱甘肽維持的非酶促反應恢復到其初始狀態[32]。研究表明,硒代L-甲硫氨酸通過下調磷酸酯酶-張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)表達水平,而上調p-PI3K、p-AKT水平及β-catenin、Runx2表達水平,抑制過氧化氫對BMSCs活力的不利影響,進而提高BMSCs增殖率、成骨相關蛋白表達水平。目前,已有相關報道白楊素激活PI3K/AKT/Nrf2通路,保護BMSCs免受氧化應激的影響,從而促進糖尿病SD大鼠顱骨缺損的骨再生[33]。

氧化應激還可以通過調控NMNAT3-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)-SIRT3等相關通路來調節線粒體功能,從而影響BMSCs的增殖。過多的ROS會下調沉默信息調控因子樣蛋白3(silent information regulator 3,SIRT3)和上調乙酰化SOD2,使線粒體基質內超氧化物歧化減少,導致細胞線粒體功能障礙而使抗氧化能力下降,抑制BMSCs的分化與增殖[34]。CHEN等[35]研究發現,白藜蘆醇以劑量依賴的方式激活AMPK/PGC-1α/SIRT3軸增強SIRT3表達,明顯減輕糖皮質激素誘導的股骨頭壞死(glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head,GIONFH)模型大鼠氧化應激損傷,恢復BMSCs成骨潛能,防止GIONFH的發生。此外,JIANG等[36]研究結果顯示,白藜蘆醇還可以增強OVX小鼠對氧化應激的抵抗力,并通過激活SIRT1和FoxO1去乙酰以調節包括SOD在內下游靶點抗氧化酶的氧化損傷,加速BMSCs的成骨作用,可作為治療骨質疏松癥的新藥理靶點。

此外,相關研究表明氧化應激也可能通過NMNAT3-NAD+-SIRT3軸上調SIRT3依賴的去乙酰化相關蛋白異檸檬酸脫氫-2(isocitrate dehychogenase 2,Idh2)和叉頭轉錄因子O3a(forkhead box O3a,FoxO3a)乙酰化水平,從而對線粒體結構和功能的損傷加重,導致BMSCs活力下降,增殖能力減弱,阻滯細胞生長[37-38]。煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶3(nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 3,NMNAT3)除了在合成NAD+中發揮重要作用,在氧化應激下條件下,過表達NMNAT3的BMSCs細胞內NAD+上調,SIRT3的活性增強,明顯改變線粒體中Idh2和FoxO3a表達,有效改善氧化應激下BMSCs的線粒體結構,增加線粒體膜電位,增加ATP合成,促進線粒體生物發生調節因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activatedreceptorγcoactivator 1α,PGC-1α)和核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor,NRF1)表達[39],見圖1。

圖1 氧化應激通過相關通路對BMSCs增殖的影響示意圖

2.2 對細胞分化的影響

BMSCs是一種多分化的干細胞,其在整個發育過程中一直保持干性,直到被應激源和生理需求觸發分化[40]。但是BMSCs分化為一種譜系后逐漸喪失向另一種譜系分化的潛能,即BMSCs定向成骨細胞分化后會阻止BMSCs向其他細胞分化[41]。BMSCs的成脂傾向是骨質疏松中海綿樣骨形成的主要原因[42]。氧化應激不僅降低了BMSCs活力和增殖指數,而且還明顯抑制BMSCs成骨方向的分化,反而促進其向成肌、成脂等其他方向分化,使成骨基因(包括ALP、OPN和Runx2)下調,導致骨形成減少,不利于成骨[43-46]。

氧化應激可通過調控無翅整合基因(wingless int,Wnt)/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化。經典Wnt信號通路由胞外Wnt配體通過卷曲蛋白(Fr2)家族中的7次跨膜受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(Lrp5/6)傳遞信號,使β-catenin向細胞核聚集和易位,并與轉錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子(T-cell factor/Lymphocyte enhancer factor,TCF/LEF)在細胞核相結合,從而調控下游通路靶基因Runt相關轉錄因子2(Runx2)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)的表達,而這兩個基因分別是成骨和脂肪形成的主轉錄因子[46-48]。正常情況下,Wnt/β-catenin信號通路在BMSCs定向成骨分化中發揮至關的重要作用,使BMSCs更趨向于成骨細胞分化[49]。研究表明,ROS可能通過激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)信號通路然后直接磷酸化TCF,導致β-catenin與TCF結合減少,下調成骨相關因子表達,抑制BMSCs成骨分化,使BMSCs更趨向于成脂和成軟骨方向分化[50]。相關研究發現,氧化應激可能通過抑制BMP/Smad通路降低SOD和GPx的活性,下調Runx2、ColⅠ、OCN等成骨相關基因表達,從而負性調節BMSCs的成骨分化,使其傾向于其他方向分化[51]。

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員中的骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),在成骨分化中發揮重要作用的。氧化應激反應會抑制BMP的表達,使BMP-2與其受體(BMPR-Ⅰ、BMPR-Ⅱ)之間在細胞表面形成復合物減少,下調BMPR I對Smad信號的磷酸化表達;同時,TGF-β1與BMPR-Ⅱ的結合減少,抑制Smad下游通路激活,使得Smad與Runx2之間相互作用減少,最終引發炎癥級聯反應抑制抗氧化酶的活性,減少BMSCs的成骨分化[52]。有研究顯示,桃葉珊瑚苷(aucubin,AU)不僅可以通過激活Nrf2/HO1信號通路,保護骨折愈合免受氧化應激損傷,還可以部分通過BMP2/Smads信號通路促進BMSCs成骨,促進骨折愈合[53]。

氧化應激也可以通過PI3K/AKT/FoxO1通路負向調控BMSCs向成骨譜系的分化[54]。過量ROS引起的氧化應激會激活FoxO信號通路發揮抗氧化功能,同時降低PI3K和AKT的磷酸化水平,進而使ALP活性、Runx2和β-catenin表達水平下降,導致BMSCs的成骨分化能力下降[55]。此外,過量的ROS會促進腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達,形成一個正反饋回路,即一個惡性循環,可以激活下游靶點NF-κB信號通路,上調NADPH氧化酶(包括NOX1和NOX2)的表達,下調SOD1和CAT的表達[56]。

此外,氧化應激會阻斷細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2信號通路,通過下調ERK和環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)可以抑制成骨分化,上調半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)激活、LDH水平,同時,PPARγ2和脂蛋白脂肪酶的表達增加,有利于成脂分化,抑制BMSCs成骨譜系分化,使骨形成降低[57-58],見圖2。

LRP:脂蛋白受體相關的蛋白5/6;OB:成骨細胞。圖2 氧化應激通過相關通路對BMSCs分化的影響示意圖

2.3 對細胞凋亡的影響

在氧化應激過程中,BMSCs的端粒長度縮短,細胞發生了復制性衰老,其增殖、分化能力均降低。氧化應激通過抑制關鍵的DNA修復因子(如53BP1),引起不可逆的細胞周期阻滯、細胞增殖抑制,而且衰老相關β-半乳糖苷酶的活性增加及激活p53、p21等細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子表達增多,進而促進BMSCs的衰老過程,誘導BMSCs凋亡[59]。ROS水平的升高促進了JNK的磷酸化,該激酶從細胞質轉移到線粒體,導致caspase-3激活,隨后凋亡[60]。其次,在過氧化氫誘導的BMSCs模型中,氧化應激會上調促凋亡蛋白Bax、Bak和caspase-3的表達,同時下調抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達,增強細胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)釋放,進一步激活caspase級聯反應,促進caspase誘導的BMSCs凋亡[61-62]。此外,過多的電離輻射誘導機體內產生TNF-α,觸發激活caspase-3和caspase-8;同時激活下游血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein,SAA)等相關表達的細胞因子,并通過Toll樣受體2(toll-like receptor 2,TLR2)和甲酰肽受體2(formyl peptide receptor 2,FPR2)兩個受體來調節炎癥反應因子,進而誘發炎癥級聯反應,觸發ROS積累和持續的氧化應激,激活DNA損傷相關蛋白的表達,均可明顯誘導BMSCs凋亡[63]。

ROS可誘導ERK、JNK、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)等絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族通路的激活,激活細胞凋亡因子、p53、p38MAPK和DNA損傷反應途徑,誘導族BMSCs衰老和凋亡[64]。MARK家族是氧化應激最重要的下游信號通路之一,通常被認為是細胞存活、增殖和凋亡的調節因子。ERK通路是MAPK通路中的一個重要家族,主要由3個核心蛋白激酶(RAF、MEK和ERK)組成,相互間順序激活,共同組成一個準確高效的信號傳遞網絡,發揮其調節作用。帕金森病蛋白7(parkinson disease protein 7,PARK7)作為氧清除劑、抗氧化應激蛋白,在BMSCs存活中起著重要作用。過表達PARK7可上調BMSCs中MEK1/2、ERK1/2和E26轉錄因子1(ELK1)的磷酸化水平,增加ERK1/2核易位和SOD表達水平,促進BMSCs抗氧化應激過程,有效降低ROS和MDA水平,保護線粒體膜電位,改善過氧化氫誘導的BMSCs凋亡[65],見圖3。

P53:衰老相關因子;PAPK7:帕金森病蛋白7。圖3 氧化應激通過相關通路對BMSCs凋亡的影響示意圖

3 小結與展望

綜上所述,氧化應激已經成為骨代謝疾病中重要的研究領域之一,其通過對多種信號因子及信號通路的調控來抑制骨形成生理過程中BMSCs的增殖和分化,促進細胞衰老、凋亡,導致骨形成能力下降及骨穩態失衡,最終造成骨代謝異常。目前,已有部分研究以Nrf2/HO1、ERK1/2、PI3K/AKT/Nrf2及SIRT3、FoxO1等相關信號通路相關因子或競爭性抑制MAPK家族信號通路為靶點抑制氧化應激和炎癥反應,同時促進BMSCs的成骨分化、成骨細胞的生成、血管生成、抗氧化應激、脂肪細胞凋亡和破骨細胞凋亡等積極的影響,協調骨代謝,有望作為開發骨質疏松癥、骨折等骨代謝疾病的潛在治療藥物新靶點[66]。深入了解氧化應激對BMSCs的影響及機制對于開發新的促進骨形成藥物,乃至骨質疏松、骨折、骨缺損等臨床干預具有重要意義,后續研究中應進一步明確氧化應激對BMSCs的分子機制和級聯網絡,并探索開發相關靶向干預或聯合干預,為上述疾病的治療提供新的思路。