白藜蘆醇通過上調miR-361-3p逆轉卵巢癌順鉑耐藥的研究*

汪旭珍,劉 紅,俞一歆,胡立強,陳文虎

(1.杭州市婦產科醫院放射科,浙江杭州 310030;2.浙江省中醫藥研究院,杭州 310007;3.杭州醫學院,浙江杭州 310053)

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一,其5年生存率僅為48%左右[1]。對于晚期卵巢癌,減容手術聯合鉑基化療仍是主要的治療策略[2]。雖然70%的患者最初對鉑基化療有反應,但大多數患者會出現嚴重的不良反應,并且不可避免地由于化療耐藥性而復發[3]。因此,提高卵巢癌對化療的敏感性,減少相關副作用,有望延長卵巢腫瘤患者的生存期,提高其生活質量[4]。鉑基化療是晚期卵巢腫瘤的標準一線治療方法。順鉑(cisplatin,DDP)作為最重要的鉑類藥物之一,在臨床上得到廣泛應用,但耐藥性的產生是限制其療效的重要原因[5]。因此,迫切需要尋找可以增強DDP抗腫瘤活性的其他藥物。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種天然的多酚類化合物,來源于葡萄、花生、桑樹等多種植物[6]。據報道,RES具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多種生物學功能?；谶@些生物學功能,RES在醫學中得到了廣泛的研究。在抗腫瘤研究中,RES與DDP聯合使用可明顯逆轉腫瘤細胞對化療的耐藥性[7-8]。然而,RES增加DDP化學敏感性的分子機制尚不明確。

微RNA(microRNA,miR)是一類小的非編碼RNA分子,包含約22個核苷酸[9]。miR對許多生理病理過程起著至關重要的作用,如細胞穩態、發育和分化、存活和死亡、腫瘤起始和進展、腫瘤化療和耐藥等[10]。miR-361-3p是一種新發現的miR,在多種惡性腫瘤中減少或丟失。既往研究報道,miR-361-3p通過抑制胰腺導管腺癌中雙特異性磷酸酶2(DUSP2)的表達來調節細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)信號通路,誘導上皮間質轉化(EMT)[11]。雖然WANG等[12]將miR-361-3p視為抑制卵巢癌生長和侵襲的抗腫瘤miR,但其在卵巢癌對DDP耐藥中的作用機制需進一步探索。本研究發現,RES可以逆轉卵巢癌對DDP的耐藥性,上調miR-361-3p的表達,并進一步探討了其可能的分子機制,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

人卵巢癌SKOV3細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,在含10%胎牛血清(美國HyClone公司)和100 mg/L青霉素/鏈霉素(美國Gibco公司)的DMEM培養基(美國HyClone公司)中生長。

1.1.2主要試劑

RES、DDP購自北京索萊寶科技有限公司;miR-361-3p抑制劑等相關試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司;細胞計數試劑盒8(CCK-8)試劑和膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/PI)凋亡試劑均購自日本同仁化學研究所;TRizol、miR逆轉錄試劑盒、TB Green熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司;所有抗體均購自美國CST抗體公司。

1.2 方法

1.2.1SKOV3/DDP耐藥細胞株構建

SKOV3細胞培養于含0.4 μmol/L DDP培養基中,以80%的密度傳代。2周后,將細胞接種到新的6孔板中,并在含有增加DDP濃度(先前濃度的1.5倍)的培養基中培養。重復該過程,直到細胞在4 μmol/L DDP培養基中表現出穩定的生長和增殖。

1.2.2CCK-8法檢測RES安全濃度

取對數生長期SKOV3/DDP細胞,以每孔4×103個接種于96孔板,置于培養箱中過夜培養,加入濃度分別為2、4、8、16、32 μmol/L的RES,0 μmol/L RES作為對照組(CON組),完全培養基作為空白組,6孔平行,繼續培養48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃培養3 h,用酶標儀檢測各孔450 nm波長處吸光度(A450)值,實驗重復3次。按照下列公式計算藥物對細胞活力的殺傷效應:細胞活力(%)=(試驗組A450值-空白組A450值)/(對照組A450值-空白組A450值)×100%。

1.2.3CCK-8法檢測細胞半數抑制濃度(IC50)

采用不同DDP濃度(4、8、16、32、64、128 μmol/L)作用SKOV3/DDP細胞48 h(DDP組),以及RES(濃度為4 μmol/L)與DDP聯合作用細胞48 h(RES+DDP組)后進行CCK-8實驗。每孔中加入10 μL CCK-8溶液,在培養箱中孵育3 h,使用酶標儀測量A450值,使用GraphPad軟件計算IC50。

1.2.45-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)技術檢測細胞增殖能力

取對數生長期SKOV3/DDP細胞,以每孔1×105個接種于24孔板,置于培養箱中過夜培養,分別用DDP IC50和DDP IC50聯合RES(濃度為4 μmol/L)處理48 h后加入EdU液37 ℃孵育2 h。4%多聚甲醛固定30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后復染4,6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI),熒光顯微鏡下觀察細胞增殖情況。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期SKOV3/DDP細胞,以每孔1×105個接種于24孔板,置于培養箱中過夜培養,分別用DDP IC50和DDP IC50聯合RES(濃度為4 μmol/L)處理細胞48 h,胰酶消化,PBS洗滌,根據Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書,加入500 μL緩沖液重懸細胞,再分別加入5 μL Annexin V-FITC溶液與10 μL PI染色液,輕輕混勻,室溫孵育15 min,轉移至上樣管中,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6實時熒光逆轉錄PCR(RT-qPCR)檢測miR-361-3p表達水平

收集RES處理前后的SKOV3/DDP細胞,用TRIzol提取細胞總RNA,測定其純度和濃度,按照逆轉錄試劑盒說明書用逆轉錄酶將其合成互補DNA(cDNA)。使用TB green試劑盒進行RT-qPCR檢測。參數如下:95 ℃反應10 s;95 ℃反應5 s,60 ℃反應20 s,40個循環。反應結束后miR-361-3p以U6為內參對照,以2-ΔΔCt法量化相對表達水平。miR-361-3p正向引物:5′-UCC CCC AGG UGU GAU UCU GAU UU-3′,反向引物:5′-GCA AAT CAG AAT CAC ACC TG-3′。U6正向引物:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,反向引物:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.2.7細胞轉染

NC抑制劑和miR-361-3p抑制劑按照公司提供的說明書使用。將SKOV3/DDP細胞以5×105個/孔的密度接種在6孔板中,用脂質體(LipofectamineTM2000)進行轉染。轉染6 h后,用PBS洗滌細胞3次,換成普通培養基,繼續培養48 h。通過RT-qPCR檢測轉染效率。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達

收集對照組、DDP IC50、DDP IC50聯合RES(濃度為4 μmol/L)處理的細胞,用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定提取的蛋白水平。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質,轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用含有5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水(TBST)室溫封閉2 h。加入待測一抗[ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、P38、磷酸化P38(p-P38)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)],稀釋濃度為1∶1 000,在4 ℃下孵育過夜。次日,將PVDF膜與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗4 ℃孵育2 h,通過電化學發光(ECL)法顯色,Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 RES對SKOV3/DDP細胞的安全濃度檢測

利用CCK-8法篩選單用RES對SKOV3/DDP細胞的最大安全濃度,結果顯示:當RES終濃度為4 μmol/L時,對SKOV3/DDP細胞生長無明顯抑制作用(P>0.05),見圖1。因此,本實驗選用4 μmol/L濃度為RES的聯用劑量。

a:P<0.05,與0 μmol/L組比較。圖1 單用RES對SKOV3/DDP細胞安全濃度的篩選

2.2 RES聯用DDP對SKOV3/DDP細胞增殖和凋亡的影響

利用CCK-8法檢測DDP組和RES+DDP組對SKOV3/DDP細胞的IC50,與DDP組相比,RES+DDP組的IC50明顯降低(P<0.05),見圖2。EdU增殖實驗顯示,RES+DDP組的細胞增殖率明顯低于DDP組(P<0.05),見圖3A、B。流式細胞術檢測細胞凋亡,與DDP組相比,RES+DDP組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05),見圖3C、D。

a:P<0.05,與DDP組比較。圖2 RES聯合DDP對SKOV3/DDP細胞IC50的影響

A、B:各組細胞的細胞增殖率;C、D:各組細胞的細胞凋亡率;a:P<0.05,與CON組比較;b:P<0.05,與DDP組比較。圖3 RES聯合DDP對SKOV3/DDP細胞增殖和凋亡的影響

2.3 RES作用后miR-361-3p的表達

采用RT-qPCR檢測RES作用后SKOV3/DDP細胞中miR-361-3p的表達,與作用前(CON組)相比,RES作用后(RES組)SKOV3/DDP細胞miR-361-3p表達明顯上調(P<0.05),見圖4。

a:P<0.05,與CON組比較。圖4 RES對miR-361-3p的表達調控

2.4 RES通過miR-361-3p逆轉SKOV3/DDP細胞的DDP耐藥性

采用RT-qPCR法檢測miR-361-3p抑制劑作用后SKOV3/DDP細胞中miR-361-3p的表達,結果顯示:miR-361-3p的表達明顯下調(P<0.05),見圖5A。與DDP組相比,NC抑制劑+RES+DDP組和miR-361-3p抑制劑+RES+DDP組可以明顯降低IC50值(P<0.05),且NC抑制劑+RES+DDP組明顯低于miR-361-3p抑制劑+RES+DDP組(P<0.05),見圖5B。EdU增殖實驗顯示,NC抑制劑+RES+DDP組的細胞增殖率明顯低于DDP組(P<0.05),而miR-361-3p抑制劑+RES+DDP組的細胞增殖率明顯高于NC抑制劑+RES+DDP組(P<0.05),且與DDP組比較無明顯差異(P>0.05),見圖5C、D。流式細胞術結果顯示,NC抑制劑+RES+DDP組的細胞凋亡率明顯高于DDP組(P<0.05),而miR-361-3p抑制劑+RES+DDP組的細胞凋亡率明顯低于NC抑制劑+RES+DDP組(P<0.05),且與DDP組比較無明顯差異(P>0.05),見圖5E、F。

A:RT-qPCR檢測miR-361-3p在SKOV3/DDP細胞中的相對表達;B:各組DDP的IC50值;C、D:各組細胞的細胞增殖率;E、F:各組細胞的細胞凋亡率;a:P<0.05,與NC抑制劑組比較;b:P<0.05,與DDP組比較;c:P<0.05,與NC抑制劑+RES+DDP組比較。圖5 RES通過miR-361-3p逆轉SKOV3/DDP細胞的DDP耐藥

2.5 RES通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號通路調節DDP對SKOV3/DDP細胞的作用

采用Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2、P38及p-P38蛋白水平,結果發現:與CON組相比,DDP組、RES+DDP組的p-ERK1/2、p-P38蛋白水平明顯下調(P<0.05),且RES+DDP組明顯低于DDP組(P<0.05);而ERK1/2,P38蛋白水平無明顯變化,見圖6。

A:p-ERK1/2與ERK1/2蛋白的相對比值;B:p-P38與P38蛋白的相對比值;a:P<0.05,與CON組比較;b:P<0.05,與RES-DDP組比較。圖6 RES和DDP對MAPK/ERK信號通路相關蛋白的調控

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤,且預后較差,對女性患者的生命造成嚴重威脅。雖然80%的卵巢癌患者對以鉑類為主的一線化療方案敏感,但復發率高達60%以上;并且,其中大部分患者在一線化療后會出現繼發的耐藥,而卵巢癌的耐藥導致化療藥物無法對卵巢癌細胞進行有效的殺傷和抑制,進而導致病情惡化[13-14]。卵巢癌化療耐藥的機制研究也成為近年來研究的熱點和難點[15]。

RES是重要的植物抗毒素,廣泛存在于葡萄、虎杖及藍莓等植物中,具有保護心血管系統、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗病原微生物、保肝、抗癌等多種藥理作用[16-17]。研究表明,RES通過誘導結腸癌細胞內線粒體介導的凋亡,抑制Wnt/β-連環素(β-catenin)信號通路下游蛋白的表達,對結腸癌的治療具有積極作用[18]。RES通過絲氨酸蘇氨酸激酶/核因子-κB(Akt/NF-κB)信號通路抑制了骨肉瘤干細胞標志物CD133的表達,介導信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)信號通路對骨肉瘤干細胞發揮殺傷作用[19]。此外,RES協同DDP促進線粒體中細胞色素C的釋放從而增加腫瘤細胞凋亡[20]。本研究通過CCK-8和EdU實驗發現,RES聯用DDP可以明顯抑制SKOV3/DDP的增殖作用。同時,流式細胞術結果顯示,RES+DDP組的細胞凋亡率明顯升高。提示RES在逆轉SKOV3/DDP細胞DDP耐藥中的作用具有良好的應用前景。

miR是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA[9],主要通過參與基因的轉錄后調控來實現對靶基因的表達調節。目前,已有大量的研究結果表明,miR在動植物生長發育、機體疾病的發生與發展等領域中備受關注。研究報道,在乳腺癌中轉染miR-34a明顯抑制多柔比星耐藥的MCF-7/A細胞的增殖、侵襲、遷移并誘導其凋亡[21]。而miR-214通過靶向卵巢癌中的第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)導致細胞存活和DDP耐藥[22]。此外,研究發現miR-340在DDP耐藥的肝細胞癌(HCC)細胞中明顯下調,外源性miR-340表達可抑制核因子E2相關因子(Nrf2)表達,促進HepG2/DDP細胞的DDP敏感性[23]。然而,miR-361-3p在卵巢癌中與DDP敏感性之間的關系尚不明確。本研究發現,RES可上調SKOV3/DDP細胞中miR-361-3p的表達。進一步轉染miR-361-3p抑制劑顯示,可以明顯逆轉RES協同DDP的腫瘤殺傷作用。這提示miR-361-3p可能是RES逆轉SKOV3/DDP細胞耐藥的潛在靶標。

MAPK信號途徑是細胞內重要的信號轉導通路之一,參與細胞的生長、發育、分化、凋亡等一系列細胞生理活動,且與腫瘤細胞的DDP耐藥性有關。有研究顯示,MAPK信號通路抑制劑可抑制宮頸癌細胞增殖作用,并增強其DDP藥物敏感性[24]。采用U0126抑制MAPK/ERK信號通路后,MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細胞的增殖速度明顯減緩,逆轉了乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性[25]。為進一步探討RES協同DDP對SKOV3/DDP的耐藥分子機制,使用Western blot檢測了MAPK/ERK信號通路中ERK1/2、p-ERK1/2、P38及p-P38蛋白表達水平。結果顯示,RES聯用DDP明顯降低ERK1/2和P38蛋白的磷酸化水平,抑制了MAPK/ERK信號通路的激活。這揭示了RES逆轉DDP對SKOV3/DDP細胞耐藥的潛在分子機制。

綜上所述,RES能通過上調miR-361-3p水平而降低卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP的耐藥性,從而抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡,進一步分析RES可抑制MAPK/ERK信號通路的活化。未來的研究除了著眼于分子水平上探索細胞自噬與腫瘤的關系,還應密切關注細胞自噬的臨床應用。由于細胞自噬對不同腫瘤細胞的耐藥性影響不同,所以在實際應用中還需要做大量的臨床前期實驗,以期望做到針對不同的腫瘤細胞選用不同的治療策略,從而避免對正常細胞及組織的損傷。RES聯合DDP治療有望應用于卵巢癌治療研究領域,從而逆轉卵巢癌細胞的耐藥性,提高卵巢癌臨床治療效果。