KIF21B在腎細胞癌中的表達及其對腎癌細胞786-O凋亡的調(diào)控作用研究

侯 驍,茍 欣

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科 400016)

腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤患者的第二大死因[1],局部或早期腎細胞癌可通過手術治療[2]。雖然腎細胞癌早期診斷率不斷提高,但仍有20%～30%的腎細胞癌患者在初次治療期間存在遠處轉移跡象[3]。晚期腎細胞癌的5年生存率極低,主要原因是對放療和化療的抵抗[4]。闡明腎細胞癌的發(fā)病機制,尋找有效的治療方法已成為當務之急。

肌動蛋白家族成員21B(kinesin family member 21B,KIF21B)屬于驅動蛋白超家族[5]。人類驅動蛋白分為14個家族,由45種不同的驅動蛋白組成,參與一系列細胞過程,如有絲分裂、運動、細胞器轉運和腫瘤發(fā)展[6]。研究證實,KIF21B在包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種類型細胞中表達[7]。然而,關于KIF21B蛋白與人類腫瘤關系的研究較少[8-9]。KIF21B在癌癥,尤其是腎細胞癌中的功能和調(diào)控機制,及其對預后的影響尚未得到廣泛研究。因此,本研究觀察了腎細胞癌組織和腎癌細胞株中KIF21B相對于癌旁組織和人胚腎細胞的表達差異,進一步研究了KIF21B對腎癌細胞786-O凋亡的調(diào)節(jié)作用及其分子機制,為腎細胞癌早期診斷及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床組織

所有腎細胞癌組織和相應的癌旁組織來自本院2020年4月至2021年8月接受腎癌根治性切除/部分切除術患者。所有患者均為初發(fā)病例且在手術前未進行放化療,術后經(jīng)病理診斷確診腎透明細胞癌。所有患者均簽署知情同意書,所有試驗均獲得本院倫理委員會的批準與監(jiān)督[批號:2023年科研倫理(2023-18)]。

1.1.2細胞

人胚腎細胞HEK293和人腎癌細胞株786-O、ACHN、A498和Caki-1購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.1.3主要儀器與試劑

多聚甲醛、Triton X-100、DAPI購于上海碧云天生物技術有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司;青霉素、鏈霉素、山羊血清、RIPA裂解液、中性樹脂、DAB染色試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)購于上海碧云天生物技術有限公司;KIF21B沉默慢病毒、陰性對照慢病毒購于上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司;Tunel凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒、凝膠試劑盒、增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司;聚偏二氟乙烯膜購于美國Millipore公司;KIF21B抗體(PA5-45832)購于賽默飛生物制藥(杭州)有限公司;磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗體(WL02849)、蛋白激酶B(AKT)抗體(WL0003b)、Bcl-2抗體(WL01556)、Bax抗體(WL01637)、Actin抗體(WL0002d)、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(WLA023)購于沈陽萬類生物科技有限公司;p-PI3K抗體(#17366)、p-AKT抗體(#4060)購于美國Cell Signaling Technology公司。凝膠掃描儀購于美國Bio-Rad公司;流式細胞儀購于美國BD公司;LightCycler 480定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀購于美國Roche公司;倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司;熒光顯微鏡購于日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學

新鮮組織標本采用10%甲醛固定和石蠟包埋切片后備用。5 μm石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后采用熱處理法進行抗原修復,采用枸櫞酸鹽緩沖液100 ℃水浴15 min。采用3%過氧化氫水溶液浸泡切片15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,使用含10%山羊血清的PBS封閉切片。在4 ℃下孵育一抗稀釋液(KIF21B,1∶500稀釋)過夜,隨后在37 ℃下孵育二抗60 min,室溫下行DAB染色,蘇木素復染2 min,梯度脫水和透明后中性樹脂封片。

隨機選擇5個高倍視野,計算染色細胞的百分比及染色程度,量化評分后取平均值。染色細胞所占百分比:無染色細胞(0分),>0～25%(1分),>25%～50%(2分),>50%～75%(3分)和>75%～100%(4分)。染色程度:無染色(0分),淺棕色(1分),棕黃色(2分)和深棕色(3分)。最終得分為上述兩個評分相乘:0分為陰性(-);>0～3分為弱陽性(+);>3～6分為陽性(++);>6～12分為強陽性(+++)。

1.2.2蛋白印跡法(Western blot)

采用RIPA裂解液冰上裂解待測組織或細胞,離心提取并收集待測樣本總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒操作說明書對總蛋白濃度進行定量分析。按照80 μg上樣量計算待測樣品的上樣體積。按照試驗步驟進行電泳,先80 V電泳45 min,再120 V電泳120 min。250 mA轉膜120 min后室溫封閉120 min。隨后4 ℃下一抗孵育過夜,PBST洗膜10 min 3次。室溫下二抗稀釋液孵育120 min,PBST洗膜10 min 3次。最后采用ECL顯影曝光,Image J圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。

1.2.3細胞培養(yǎng)

所有細胞使用含10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱,每兩天更換培養(yǎng)基、傳達培養(yǎng)。

1.2.4細胞轉染

人KIF21B特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)序列(GGAGCTGATGGAGTATAAG)和陰性對照序列(TTCTCCGAACGTGCACGT)購于上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。根據(jù)試劑說明書,shKIF21B組細胞轉染沉默慢病毒,Negative control組細胞轉染空載體慢病毒,Blank control組細胞不做處理,感染復數(shù)(MOI)為20。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)12 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.5Tunel

將轉染好且生長狀態(tài)良好的各組細胞種至6孔板,5×104個細胞/孔。待細胞貼壁后,棄培養(yǎng)基并用PBS潤洗細胞10 min 3次,4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min,Triton X-100孵育5 min,PBS潤洗10 min。然后,根據(jù)Tunel凋亡試劑盒操作說明制備Tunel測試溶液,每孔加入Tunel測試溶液50 mL,37 ℃孵箱避光孵育60 min。棄掉Tunel測試溶液后使用DAPI室溫避光孵育10 min染色細胞核,在熒光顯微鏡下觀察細胞核和Tunel陽性細胞,并計算5個隨機視野的陽性率(Tunel/DAPI)。

1.2.6流式細胞術

將轉染好且生長狀態(tài)良好的各組細胞種至6孔板,每孔1×106個細胞。待細胞鋪滿6孔板后,0.25%胰酶消化、離心并用PBS重懸細胞。根據(jù)細胞凋亡試劑盒操作說明,分別用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)雙染細胞,4 ℃避光孵育15 min。隨后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 KIF21B在腎細胞癌組織及腎癌細胞株中表達情況

為明確KIF21B在腎細胞癌組織中的表達情況,采用免疫組織化學染色和Western blot比較KIF21B在腎細胞癌組織和對應癌旁組織中的表達情況,結果顯示KIF21B在腎細胞癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織。采用Western blot檢測KIF21B在腎癌細胞株中的表達情況。和人胚腎細胞HEK293比較,人腎癌細胞株786-O、ACHN、A498和Caki-1中KIF21B蛋白呈不同程度上調(diào),見圖1。52例腎癌組織中KIF21B陽性表達率為82.7%,高于18例癌旁組織中KIF21B陽性表達率(16.7%),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 KIF21B在不同組織中表達水平

A:腎細胞癌組織與相應癌旁組織免疫組織化學染色圖(100×);B.腎細胞癌組織與相應癌旁組織中KIF21B相對表達水平;C、D:腎癌細胞系786-O、ACHN、A498、Caki-1與人胚腎細胞HEK293中KIF21B相對表達水平;a:P<0.05,與其他細胞株兩兩比較。圖1 腎細胞癌組織及腎癌細胞系中KIF21B相對表達水平

2.2 KIF21B表達水平與臨床病理特征的關系

為了進一步確認KIF21B的表達水平與患者臨床資料的相關性,通過免疫組織化學結果量化評分,分析KIF21B在腎癌組織中表達水平與患者臨床病理特征之間的關系,結果顯示,KIF21B在腎癌組織中的表達水平與腫瘤Furhman分期、T分期和腫瘤是否遠端轉移相關(P<0.05),與患者性別、年齡無關(P>0.05),見表2。

2.3 KIF21B對腎癌細胞凋亡的影響

為研究KIF21B在腎癌中的作用,選取相對表達水平最高的786-O細胞株進一步試驗。慢病毒轉染786-O細胞72 h后,Western blot結果顯示,沉默組786-O中KIF21B表達水平明顯低于空白對照組及陰性對照組,但兩個對照組之間KIF21B表達比較無明顯差異(P>0.05)。進一步研究KIF21B對786-O細胞凋亡的影響,采用Tunel和流式細胞術試驗,結果顯示沉默組786-O細胞凋亡水平明顯上調(diào),但兩個對照組之間細胞增殖和凋亡水平比較無明顯差異(P>0.05),見圖2。

A、B:腎癌786-O細胞KIF21B相對表達水平;C:Tunel及FCM試驗顯示各組細胞凋亡水平;Bar=100 μm;a:P<0.05,與空白對照組、陰性對照組比較。圖2 KIF21B對腎癌細胞786-O凋亡的影響

2.4 KIF21B沉默介導PI3K/AKT信號通路的抑制

為研究KIF21B對腎細胞癌細胞生物學行為的影響機制,采用Western blot檢測PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的表達水平。結果顯示,與陰性對照組比較,沉默組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表達被明顯抑制。對沉默組使用PI3K/AKT通路激動劑IGF1,進一步采用Western blot檢測,結果顯示,p-PI3K、p-AKT表達上調(diào),且促凋亡蛋白Bax表達降低,而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達上調(diào),見圖3。

a:P<0.05。圖3 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達水平

3 討 論

臨床上,超過1/3的腎細胞癌患者在最初診斷時會出現(xiàn)轉移,出現(xiàn)轉移的腎細胞癌與高致死率密切相關[10-11]。盡管治療轉移性腎癌的酪氨酸激酶抑制劑和免疫檢查點抑制劑藥物已完成開發(fā),但腎細胞癌患者的預后仍然較差,5年生存率低于10%[12]。因此,有必要闡明腎癌的發(fā)病機制,尋找新的治療靶點。

驅動蛋白與動力蛋白分子形成復合物參與細胞內(nèi)囊泡和細胞器的運輸[8]。然而,驅動蛋白的過度表達會導致紡錘體塌陷和單極紡錘形成,導致后期遺傳物質分布不均勻,形成非整倍體。非整倍體細胞中獲得或丟失的遺傳物質被認為是引發(fā)癌癥惡性進展的因素[13]。因此,研究認為驅動蛋白的異常表達與腫瘤發(fā)展具有相關性[14-15]。此前,研究人員發(fā)現(xiàn)KIF21B基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化癥、強直性脊柱炎、克羅恩病和潰瘍性結腸炎有關[9],且KIF21B的過度表達加速了神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病和多發(fā)性硬化癥)的進展,KIF21B參與興奮性突觸傳遞,沉默KIF21B的表達會抑制其功能并影響其生物學行為[16-17]。而關于KIF21B對人類腫瘤調(diào)控的作用研究非常有限,缺乏KIF21B在人腎細胞癌中的表達及其相關性機制的報道。鑒于驅動蛋白可以廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,因此本研究旨在探究KIF21B是否會對腎細胞癌產(chǎn)生調(diào)控作用。

為確定KIF21B在腎細胞癌中的表達情況,本研究收集臨床手術切除的腎細胞癌組織及相應癌旁組織,對腎細胞癌患者腫瘤組織和癌旁組織進行免疫組織化學和Western blot檢測,結果顯示,KIF21B在腎細胞癌及癌旁組織中均有表達。但是相對于癌旁組織,癌組織中的KIF21B呈高表達狀態(tài)。隨后,本研究進行了體外試驗,以人胚腎細胞為對照,Western blot檢測KIF21B在腎癌細胞系786-O、ACHN、A498、Caki-1中的表達情況。與組織實驗的結果類似,KIF21B在腎癌細胞系中呈明顯高表達,且以786-O細胞株為著,表明KIF21B在腎細胞癌中可能是一種致癌基因。

在敲降786-O中的KIF21B后,在培養(yǎng)細胞的過程中可觀察到細胞增殖減慢且細胞死亡增加。進一步研究敲降KIF21B后786-O細胞的凋亡水平,結果提示,KIF21B對腎癌細胞786-O的凋亡具有調(diào)控作用,低表達的KIF21B可以明顯促進786-O的凋亡。

不同的信號通路可以調(diào)節(jié)不同的生命活動和細胞行為。PI3K/AKT是一個重要的細胞信號通路,由PI3K及其下游分子絲氨酸/蘇氨酸AKT構成[18]。通路的激活和磷酸化為PI3K轉位到膜提供錨定位點,從而參與各種細胞外基質分子和細胞因子的轉導[19]。該信號通路對細胞也具有重要的生物學作用,廣泛參與各種生理過程[20]。另一方面,PI3K/AKT信號通路也是癌癥中最常見的失調(diào)通路之一[21]。PI3K/AKT通路已成為治療癌癥藥物開發(fā)的主要焦點[22],PI3K/AKT信號通路已被證明參與驅動蛋白對腫瘤的調(diào)控[23-24]。因此,作者猜想PI3K/AKT可能在KIF21B對腎癌細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮作用。通過Western blot檢測敲降KIF21B后786-O細胞中PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的表達水平,結果證實低表達的KIF21B可以抑制786-O中PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的表達,表明KIF21B可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)腎細胞癌的凋亡。

綜上所述,KIF21B作為致癌基因在腎細胞癌和腎癌細胞中高表達,提示KIF21B在腎細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中作為癌基因被異常激活。敲降KIF21B后,腎癌細胞786-O的凋亡明顯增加,表明KIF21B可以調(diào)控腎癌細胞的凋亡并調(diào)控腎癌細胞的發(fā)生、發(fā)展。另一方面,KIF21B對腎癌細胞凋亡的調(diào)控可能與PI3K/AKT有關。此外,KIF21B表達水平與腎細胞癌的臨床分期分級和預后是否存在相關性,以及KIF21B對腎癌細胞的其他生物學行為是否有調(diào)控作用及其具體的調(diào)控機制,還有待進一步研究。