安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗治療Lewis肺癌的動物實驗研究*

陳 熙,趙曉龍,饒 文,楊宇馨,代曉燕,熊艷麗,戴 楠,王 東△

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心/大坪醫(yī)院腫瘤科,重慶 400042;2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院腫瘤血液科 401120;3.解放軍第956醫(yī)院外一科,西藏林芝 860000;4.陸軍第75集團軍醫(yī)院感染科,云南大理 671003)

肺癌是癌癥死亡的主要原因,占全球癌癥死亡總數(shù)的18.0%[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最主要的類型,約占所有肺癌的85%[2]。大部分的NSCLC患者在確診時已經(jīng)屬于晚期,失去了手術(shù)根治的機會,總體預(yù)后較差[3]。2022年中國和美國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)估計,肺癌將成為中美兩國男性和女性的最大死因[4]。近20年來,靶向治療與免疫治療進展迅速,晚期NSCLC的診療方案也逐步走向精準化[5]。以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)-酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)為主的靶向治療已成為驅(qū)動基因突變患者公認的一線治療方案;而對于驅(qū)動基因陰性的患者來說,以免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)為代表的免疫治療聯(lián)合化療則是指南推薦的一線標準治療模式之一。同時,為了減少化療的不良反應(yīng),臨床上也期待部分人群能夠使用“Chemo-free”的治療方案以實現(xiàn)高效低毒的腫瘤治療目標。基于上述需求,研究者們開展了多項基礎(chǔ)和臨床研究,以期探索更有效的聯(lián)合治療方案,其中,抗血管生成藥物聯(lián)合免疫治療就是當前研究的熱點,也是最具潛力的方案之一。

從機制上來看,新生血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要過程[6],抗血管生成治療已被公認為一種有效的腫瘤治療模式[7]。安羅替尼作為一種新型的抗血管生成藥物,是一種口服的小分子TKI,可針對血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)1、VEGFR2/KDR、VEGFR3、c-Kit、血小板源生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)-α和成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)1、FGFR2和FGFR3等多個靶點,具有更廣泛、更有效的抗腫瘤效應(yīng)[8]。2020年我國學(xué)者通過對結(jié)腸癌、腎癌和肺腺癌患者的組織標本檢測和小鼠實驗,發(fā)現(xiàn)安羅替尼可下調(diào)腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞的程序性死亡受體1(PD-1)表達,影響CD8+T細胞浸潤從而抑制腫瘤生長[9]。隨后,在一項小樣本量的回顧性研究中,發(fā)現(xiàn)26例晚期腫瘤患者(肺癌、膽囊癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌和黑色素瘤)進行安羅替尼聯(lián)合ICIs的一線至三線治療,患者均可獲得一定療效且對藥物不良反應(yīng)耐受性良好[10]。但安羅替尼聯(lián)合ICIs的機制及對腫瘤組織免疫微環(huán)境和全身免疫狀態(tài)的影響尚未完全清楚。本實驗利用安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗處理Lewis肺癌荷瘤小鼠,在證實聯(lián)合治療療效的同時,進一步探索聯(lián)合治療對免疫微環(huán)境的影響及其相關(guān)機制,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6雌性小鼠(6～8周齡)購自陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心,小鼠Lewis肺癌細胞(lewis lung cancer,LLC)購自中科院細胞庫。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)試劑和基質(zhì)膠均購自美國Corning公司;免疫組織化學(xué)相關(guān)抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;免疫組織化學(xué)抗原修復(fù)緩沖液乙二胺四乙酸購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;安羅替尼由正大天晴藥業(yè)集團(中國南京)提供;注射用小鼠PD-1單抗(克隆RMP1-14)購自美國BioXCell公司;CD4(批號ab183685)、CD206(抗甘露糖受體抗體,批號ab64693)、CD68(批號ab283654)、CD31(批號ab-28364)購自美國Abcam公司;CD8(批號98941)購自美國CST公司;辣根過氧化物酶標記的小鼠/兔通用型二抗(批號SAP-9100)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

將凍存的LLC在37 ℃的水浴鍋中快速振蕩解凍后在無菌臺上進行操作,加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基后離心,棄上清液,加入適量DMEM培養(yǎng)基,吹打混勻后得到細胞懸液,置于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)。當培養(yǎng)皿中的細胞密度達到80%～90%時,按1∶2的比例進行細胞傳代培養(yǎng)。收集細胞并計數(shù),用于構(gòu)建LLC小鼠移植瘤模型。

1.2.2LLC小鼠移植瘤模型

提前備好基質(zhì)膠,將收集好的LLC用磷酸鹽緩沖液稀釋重懸后計數(shù),得到濃度為1×107個/mL細胞懸液,將細胞懸液與基質(zhì)膠按照1∶1比例充分混勻,取100 μL上述混懸液(含5×105個細胞)用注射器在小鼠左后肢內(nèi)側(cè)腹股溝處皮下接種。

1.2.3實驗分組與處理

小鼠成瘤率超過50%時將其分為對照組、安羅替尼組、PD-1單抗組、聯(lián)合組,每組5只。給藥方式:安羅替尼組每天灌胃安羅替尼(2.25 mg/kg),給藥12 d;PD-1單抗組于第1、3、5、7天腹腔注射PD-1單抗(10 mg/kg);對照組灌胃和腹腔注射同等劑量生理鹽水。給藥期間每天觀察小鼠情況,在第13天收集各組荷瘤小鼠眼球血,頸椎脫臼處死,完整切取皮下移植瘤。腫瘤組織用電子天平稱取質(zhì)量,并按以下公式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=(對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.4免疫組織化學(xué)

小鼠腫瘤組織用4%甲醛固定,石蠟包埋,4 μm切片,置于60 ℃孵箱中3 h,采用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇脫蠟水化。切片于緩沖液乙二胺四乙酸中抗原修復(fù)10 min,置入3%過氧化氫-甲醇溶液中浸泡15 min,磷酸鹽緩沖液洗3次,每次5 min,晾干后加入山羊血清封閉30 min,之后滴加一抗如下:CD4使用時按照1∶1 000稀釋,CD8使用時按照1∶300稀釋,CD206使用時按照1∶5 000稀釋,CD68使用時按照1∶100稀釋,CD31使用時按照1∶50稀釋;將滴加抗體的切片放入切片盒,置于4 ℃冰箱過夜。次日取出切片盒,常溫下復(fù)溫1 h,并用磷酸鹽緩沖液洗3次,每次3 min。迅速滴加辣根過氧化物酶標記的小鼠/兔通用型二抗,置于37 ℃孵箱,30 min后取出,磷酸鹽緩沖液洗2次,每次5 min。滴加DAB顯色,沖洗后用蘇木素復(fù)染,脫水封片、顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5免疫細胞和微血管密度(microvessel density,MVD)計數(shù)

在顯微鏡高倍鏡(200×)下對每張切片的染色區(qū)域采集4個視野圖片,計數(shù)每張圖片陽性細胞數(shù)量后取平均值,即為CD4、CD8、CD68、CD206陽性細胞數(shù)。CD31陽性染色定位于血管內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)和/或細胞膜,呈棕黃色顆粒。腫瘤間質(zhì)區(qū)任何黃染的細胞或細胞簇即使未顯示管狀結(jié)構(gòu)均計為1個微血管,內(nèi)徑>8個紅細胞或有較厚肌層的血管不計數(shù)為微血管。在低倍鏡下選取3個腫瘤微血管最豐富的區(qū)域,計算單位面積下微血管的數(shù)目,取平均值作為MVD。

1.2.6細胞因子檢測

采用Raybiotech細胞因子芯片試劑盒,按照說明書流程檢測,簡要步驟如下:將血清4 ℃,10 000 r/min,離心10 min,將上清液2倍稀釋后取100 μL行芯片檢測。取芯片,每孔加入100 μL封閉液,室溫下封閉30 min。移除封閉液,加入稀釋后的樣品,4 ℃過夜。Wash Buffer洗滌后,加入Biotin-Antibody Cocktail,孵育2 h,洗滌。加入Cy3-Streptavidin,避光混勻,室溫孵育1 h,洗滌后采用Agilent SureScan Dx Microarray Scanner芯片掃描儀,532 nm掃描芯片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗明顯抑制LLC的生長

與對照組比較,安羅替尼組和聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量明顯減少,安羅替尼組低于PD-1單抗組(P<0.05),見圖1。PD-1單抗組、安羅替尼組和聯(lián)合組抑瘤率分別為-15.35%、73.91%和86.96%。

A:LLC小鼠移植瘤大體;B:腫瘤質(zhì)量;a:P<0.05;ns:P>0.05。圖1 各組小鼠移植瘤生長情況

2.2 安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗對LLC移植瘤組織免疫細胞浸潤的影響

與對照組比較,CD4、CD8水平在安羅替尼組、PD-1單抗組和聯(lián)合組有不同程度升高,且聯(lián)合組CD4水平較PD-1單抗組升高,CD8水平較安羅替尼組升高(P<0.05)。與對照組比較,CD68水平在安羅替尼組和聯(lián)合組有不同程度升高(P<0.05)。與對照組比較,CD206水平在PD-1單抗組和聯(lián)合組有不同程度降低,且PD-1單抗組低于聯(lián)合組(P<0.05),見圖2、3。

圖2 各組LLC小鼠移植瘤組織CD4、CD8、CD68、CD206染色浸潤代表圖(免疫組織化學(xué)染色,200×)

A:CD4+T細胞計數(shù);B:CD8+T細胞計數(shù);C:CD68+巨噬細胞計數(shù);D:CD206+巨噬細胞計數(shù);1:對照組;2:安羅替尼組;3:PD-1單抗組;4:聯(lián)合組;a:P<0.05。圖3 各組LLC小鼠移植瘤組織CD4、CD8、CD68、CD206免疫組織化學(xué)染色陽性細胞數(shù)

2.3 安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗對血管生成的影響

與對照組比較,安羅替尼組和聯(lián)合組新生血管、MVD減少(P<0.05),見圖4。

A:CD31(免疫組織化學(xué)染色,200×);B:各組MVD比較;a:P<0.05。圖4 各組CD31免疫組織化學(xué)染色情況及MVD比較

2.4 安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗影響血清中細胞因子的水平

與對照組比較,聯(lián)合組CCL5水平升高,CXCL1水平降低(P<0.05),見表1。

表1 各組細胞因子免疫熒光信號強度表達情況

3 討 論

在晚期惡性腫瘤的治療中,抗血管生成治療和以ICIs為代表的免疫治療都具有舉足輕重的地位,而二者的聯(lián)合也在晚期NSCLC、肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等臨床治療中取得了明顯療效,對不能耐受化療、拒絕化療或多線治療后進展的患者提供了一種無化療的可選方案。目前,二者聯(lián)合治療已經(jīng)應(yīng)用于晚期NSCLC 二線后乃至初治患者中。在一項阿帕替尼聯(lián)合SHR-1210的Ⅱ期臨床研究中,晚期經(jīng)治非鱗NSCLC患者聯(lián)合治療的客觀緩解率(objective response rate,ORR)和疾病控制率(disease control rate,DCR)分別為30.80%和82.44%,中位無進展生存期可達到5.9個月[11]。2019年韓寶惠教授在世界肺癌大會上報道了安羅替尼聯(lián)合信迪利單抗的多隊列Ⅰ期臨床試驗,該聯(lián)合方案在初治晚期NSCLC患者中總生存期達到26.2個月,ORR與DCR分別為30%和77%,顯示出較好的抗腫瘤協(xié)同作用[12]。此外,2020年在美國臨床腫瘤學(xué)會大會上也報道了一項安羅替尼的真實世界研究,安羅替尼聯(lián)合包括納武利尤單抗、派姆單抗在內(nèi)的PD-1單抗治療晚期NSCLC的無進展生存期可達到8個月[13]。一項Ⅲ期臨床試驗IMpower150研究(NCT02366143)數(shù)據(jù)顯示,免疫治療聯(lián)合抗血管生成治療可帶來更長的無進展生存期和總生存期,其中亞組分析提示轉(zhuǎn)移性患者、EGFR陽性患者、ALK陽性患者、KRAS突變患者可能更受益[14-18]。正是由于上述一系列的臨床結(jié)果,2020年我國《晚期非小細胞肺癌抗血管生成藥物治療中國專家共識(2020版)》正式發(fā)布[19],該共識結(jié)合薈萃分析、真實世界數(shù)據(jù)和臨床實踐,指出對于二線后、特殊人群、伴腦轉(zhuǎn)移的非鱗NSCLC及老年NSCLC患者,抗血管生成藥物聯(lián)合免疫方案將成為晚期NSCLC的一線治療的新方向。

除了臨床上的明顯療效,抗血管生成治療聯(lián)合ICIs的相關(guān)作用機制也受到研究者的廣泛關(guān)注。研究表明,缺氧條件下VEGFR2表達的增加可以促進腫瘤血管生成[6]。由于代償機制,抗血管生成單藥無法根除腫瘤[20];惡性腫瘤引發(fā)組織缺氧伴隨血管內(nèi)皮生長因子表達增高,會加劇腫瘤局部微環(huán)境的免疫抑制,使得調(diào)節(jié)性T細胞、骨髓來源的抑制性細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞等免疫抑制細胞水平升高,CD8+T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞等水平下降[21]。因此,將抗血管生成藥物與ICIs聯(lián)合可形成正反饋效應(yīng):一方面能夠使腫瘤血管正常化及重塑,逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài);另一方面,ICIs可促進激活的T細胞浸潤及殺傷腫瘤,上調(diào)γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)促進腫瘤血管正常化,使得互相增效獲得更好的臨床療效。眾所周知,抗血管生成治療藥物根據(jù)作用機制可分為以貝伐珠單抗為代表的單抗類、以恩度為代表的血管內(nèi)皮抑制素及眾多VEGFR小分子抑制劑;同時,ICIs的治療藥物也有作用于PD-1和PD-L1不同位點的抗體,那么這些藥物的不同組合是否會產(chǎn)生不同的機制效應(yīng),目前尚沒有研究報道。

為進一步明確安羅替尼與PD-1單抗聯(lián)合治療的效果及其機制,本研究對LLC小鼠進行了聯(lián)合治療,結(jié)果顯示,聯(lián)合組腫瘤質(zhì)量較對照組和PD-1單抗組明顯縮小(P<0.05),較安羅替尼組也有縮小但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明安羅替尼可明顯增強PD-1單抗的治療效果。由于免疫相關(guān)淋巴細胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用,本研究進一步對各組的主要免疫相關(guān)淋巴細胞進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞的變化尤為明顯,聯(lián)合組CD4+T細胞的數(shù)量明顯高于其他各組。CD4+T細胞是重要的抗腫瘤免疫細胞,既往研究顯示,CD4+T細胞不僅具有輔助性T細胞的功能,還有延遲性的細胞毒活性[22]。同樣,CD8+T細胞在各治療組均有升高,而且聯(lián)合治療組的CD8+T細胞的數(shù)量明顯高于其他各組。此外,巨噬細胞在各治療組均有不同程度增多,而M2型巨噬細胞明顯減少。由此可見,安羅替尼和PD-1單抗影響了腫瘤免疫微環(huán)境,聯(lián)合治療后CD4+T細胞和CD8+T細胞數(shù)量的增多,以及巨噬細胞M1型轉(zhuǎn)化M2型的抑制可能是聯(lián)合治療抗腫瘤療效的關(guān)鍵所在。本研究還對聯(lián)合治療抗血管生成作用進行了驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組與安羅替尼組治療的抗血管生成作用基本一致,并未因為ICIs的加入而減弱其抗血管生成的作用,而抗血管生成藥物能夠協(xié)同并加強免疫治療的療效已早有證實[23]。因此,從總體來看,聯(lián)合治療明顯改善了微環(huán)境。

細胞因子在調(diào)節(jié)細胞生長、損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮多種生物學(xué)功能。在腫瘤發(fā)展過程中,細胞因子不僅可以是免疫細胞的產(chǎn)物,也可作為腫瘤與免疫細胞之間的信息載體影響腫瘤免疫細胞。對細胞因子分析可從另一方面評價免疫治療的效果。本研究發(fā)現(xiàn),安羅替尼聯(lián)合PD-1單抗治療可改變機體的免疫狀態(tài),表現(xiàn)為聯(lián)合治療后CCL5有明顯升高,而CXCL1明顯下降。CCL5升高在免疫細胞的趨化和活化中發(fā)揮作用,可增強抗腫瘤免疫反應(yīng)[24]。MOWAT等[25]在DNA錯配修復(fù)基因表達缺失的腸癌研究中也發(fā)現(xiàn)CCL5作為干擾素依賴性趨化因子,以及CXCL10的過度表達可導(dǎo)致系統(tǒng)性而非局部性CD8+T細胞優(yōu)先募集和保留到腫瘤上皮中。而CXCL1的降低可以抑制髓樣細胞的遷移[26],同時促進CD8+T細胞在腫瘤部位積聚。CCL5和CXCL1的變化,可能是腫瘤組織中CD8+T細胞浸潤增多、安羅替尼增強PD-1單抗免疫治療作用的重要機制。

綜上所述,安羅替尼聯(lián)合ICIs可能通過調(diào)節(jié)細胞因子CCL5和CXCL1及增加腫瘤浸潤CD4+T細胞、CD8+T細胞來有效地抑制小鼠移植瘤的生長,該結(jié)果可為進一步制訂有效的臨床治療策略提供依據(jù)。本研究仍有一定的局限性,由于是小鼠肺癌的動物實驗,樣本量也偏少,對人體的聯(lián)合治療作用機制僅供參考,今后還需進行人類腫瘤細胞實驗和肺癌臨床試驗來驗證聯(lián)合治療的作用機制。