賀蘭山東麓‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣成分與特征變化

鄭明朋,李亞軍,張眾,何曦,陳方圓,陳建勝,張軍翔

1(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學 生命科學學院,寧夏 銀川,750021) 3(寧夏君祥葡萄酒莊有限公司,寧夏 銀川,750021)4(寧夏大學 食品科學學院,寧夏 銀川,750021) 5(寧夏葡萄與葡萄酒研究院,寧夏 銀川,750021)

香氣是葡萄酒重要的感官特征,是評價葡萄酒品質的核心指標之一[1]。目前已經在葡萄酒中檢測到了超過1 000余種揮發性物質,包括酯類、高級醇類、脂肪酸類、類異戊二烯類、醛酮類物質和含硫化合物等,這些化合物的種類、濃度、感官閾值以及各種香氣物質之間的相互作用,共同影響著葡萄酒的香氣品質[2]。在酒精發酵過程中,釀酒酵母會產生許多揮發性香氣物質,包括酯、脂肪酸和高級醇等。酯類物質是葡萄酒香氣物質中最重要的香氣物質之一,能夠給葡萄酒帶來花香和果香,葡萄酒中的酯類主要分為兩大類,分別是乙酸酯類和乙基酯類,乙酸酯由高級醇與乙酰-CoA通過酶促反應形成[3],乙基酯由乙醇和短或中鏈脂肪酸在酰基轉移酶的催化作用下形成[4]。葡萄酒中的高級醇有兩種合成路徑,一種是氨基酸在轉氨酶的作用下生成酮酸,再在脫氫酶的作用下被還原成比氨基酸少一個碳原子的高級醇,即艾利希(Ebrlich)途徑[5];另一種合成路徑是酵母菌利用糖酵解過程產生的α-酮酸,在脫羧酶、脫氫酶等的作用下,逐步合成各種高級醇[6]。酵母菌通過糖酵解作用產生乙酰-CoA,在乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的作用下,將兩分子的乙酰-CoA催化形成一分子的丙二酰-CoA。丙二酰-CoA作為碳鏈延伸供體,在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)及酰基載體蛋白(acylcarrier protein,ACP)的作用下,生成各種脂肪酸[7]。葡萄果實中的類異戊二烯以少量的游離態和大量結合態兩種形式存在,但只有游離態的類異戊二烯具有揮發性[8]。在葡萄酒釀造過程中,糖苷會在糖苷酶及酸性環境作用下水解,釋放出游離態的類異戊二烯[9]。

研究發酵過程中香氣成分及特征變化規律,對調控發酵過程中香氣成分及特征有重要意義。唐柯等[10]對威代爾冰葡萄酒發酵過程中香氣動態變化規律進行了研究,發現醇類、芳香族類、酯類、酸類、萜烯類等化合物的含量隨著發酵的進行逐漸增加,并在發酵第14天時達到最高,隨后含量降低并趨于穩定。陳明等[11]對蛇龍珠葡萄酒發酵過程中香氣變化進行了研究,發現部分香氣物質在發酵過程中始終存在,如乙酸乙酯、己酸乙酯和苯乙醇等;部分香氣物質在葡萄漿果中存在,但在發酵過程中消失了,如1-己醇、反式-2-己烯醛等;還有部分香氣是在發酵過程中產生的,如異戊醇、辛酸乙酯和乙酸異戊酯等。MA等[12]對新疆小芒森甜白葡萄酒發酵過程中的香氣成分和特征進行了研究,發現辛酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、異戊醇和辛酸等賦予了小芒森甜白葡萄酒果香和脂肪香氣。RAYMOND EDER等[13]對起泡酒瓶內二次發酵過程中香氣成分和香氣特征進行了研究,發現揮發性乙酯和萜烯類物質與起泡酒的果香和花香有關。

‘霞多麗’是世界上最古老、分布最廣泛的釀酒葡萄品種之一[14],用其釀造的干白葡萄酒深受消費者喜愛,并且在賀蘭山東麓產區也有廣泛種植。左俊偉等[15]對賀蘭山東麓產區‘霞多麗’干白葡萄酒的香氣成分進行了研究,共檢測出了49種香氣物質,香氣特征以青蘋果、草莓為主。陶永勝等[16]對中國主要葡萄酒產區‘霞多麗’干白葡萄酒的香氣特征與成分進行了研究,并確定了6種香氣特征:柑橘、菠蘿、紫羅蘭、石灰水、青蘋果和檸檬。目前,對發酵完成后‘霞多麗’干白葡萄酒的香氣成分與特征研究較多,但對釀造過程中香氣成分與特征變化的研究還鮮有報道。因此,本實驗以賀蘭山東麓產區‘霞多麗’葡萄為實驗材料,通過檢測發酵過程中香氣成分的變化,并對發酵過程中的酒樣進行香氣特征感官品評,來研究發酵過程中香氣成分與特征的變化規律,為‘霞多麗’干白葡萄酒香氣成分與特征的調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:‘霞多麗’釀酒葡萄于2021年9月1日采自賀蘭山東麓青銅峽產區,葡萄樹為5～6年的自根苗,總糖含量(以葡萄糖計)為233 g/L,可滴定酸含量(以酒石酸計)為5.85 g/L,pH值為3.67。

釀酒輔料:Excellence TXL活性干酵母、Vinozym vintage FCE果膠酶、偏重亞硫酸鉀、PVPP等,法國Lamothe-Abiet公司。

試劑及標準品:氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、濃硫酸、氯化鈉等均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;C8～C20正構烷烴(≥99.7%,GC);美國Sigma-Aldrich公司;香氣物質標品(≥98.0%,GC),日本TCI公司。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜-7000D質譜聯用儀、DB-WAX色譜柱(60 m×250 μm,0.25 μm),美國Agilent公司;PAL3自動進樣器,瑞士CTC公司;雷磁PHS-3CpH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;ME104E電子天平,瑞士METTLE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝

葡萄采收后經除梗、破碎、壓榨取汁、澄清后,將葡萄汁裝入5 L玻璃發酵罐中,做3個重復,以常規工藝進行發酵。釀造參數為加入60 mg/L偏重亞硫酸鉀、30 mg/L果膠酶,4 ℃澄清24 h、分離后接種200 mg/L TXL活性干酵母,發酵溫度控制在19～21 ℃。每天在同一時間測量比重、溫度和二氧化碳散失量,當比重降至0.994以下時,結束發酵。

1.3.2 發酵過程中的取樣

壓榨取汁澄清后采樣,記為發酵第0天。采樣結束后,接種酵母,之后每2 d在同一時間點進行采樣,每次采樣量為650 mL,直到發酵結束。采樣結束后,迅速將需要香氣成分檢測的樣品用液氮淬滅,并將樣品放入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 發酵過程中香氣特征感官品評

感官品評樣品與香氣檢測樣品同時采樣,每次采樣結束后,立即對樣品進行香氣特征感官品評。感官品評小組由20名具有2年以上葡萄酒品嘗經驗的專業人員(年齡22～30歲、男生8人、女生12人)組成,在標準品酒室(ISO 8589—1998)使用標準品酒杯(ISO 3591—1997)進行品鑒。香氣特征感官評分采用0～10分制(0分:無此類香氣;1～2分:微弱且較難分辨:3～4分:能分辨但比較微弱;5～6分:能分辨但不夠強烈;7～8分:能分辨且強烈;9～10分:非常強烈)[17]。香氣特征詞匯根據相關文獻及品評小組成員共同討論得出[15-16]。

1.3.4 揮發性成分測定

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技術對葡萄酒香氣成分進行檢測,檢測方法參考張眾等[18]的研究,并做略作修改。

頂空固相微萃取:將1.5 g氯化鈉、5 mL酒樣、10 μL 4-甲基-2-戊醇內標(1.008 3 g/L)依次加入20 mL 的頂空瓶中,并加入磁子;將頂空瓶置于集熱式恒溫磁力攪拌器中,并將纖維萃取頭置入頂空瓶中,轉速250 r/min,40 ℃萃取30 min。

色譜條件:進樣口溫度230 ℃;升溫程序:起始柱溫50 ℃,恒溫1 min,3 ℃/min 升到220 ℃,保持5 min;載氣高純氦氣(純度≥99.999%),流速1 mL/min,不分流進樣。

質譜條件:傳輸線溫度235 ℃,離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV;質量掃描范圍m/z29～350。

揮發性物質定性定量分析:提取揮發性成分質譜圖,通過NIST 17譜庫進行檢索,并根據C8～C20烷烴混合標準品的保留時間,用保留指數法(retention index,RI)計算各香氣成分的保留指數從而進行定性分析[19]。對有標品的香氣成分用其標準曲線進行定量,沒有標品的香氣成分以4-甲基-2-戊醇為內標進行半定量。對于用標準曲線定量的香氣成分,對其香氣活度值(odor activity value,OAV)進行計算,半定量的香氣成分不計算OAV。

(1)

式中:OAV,香氣活度值;香氣成分含量,μg/L;香氣閾值,μg/L。

1.3.5 數據統計分析

使用Microsoft Office 2016和IBM SPSS Statistics 23軟件進行數據統計;使用Origin 2021軟件繪制堆積柱狀圖和雷達圖,并基于其中的Heat Map with Dendrogram APP繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵階段分析

為了將‘霞多麗’干白葡萄酒的發酵階段進行劃分,對發酵時間進行聚類,如圖1所示,根據香氣成分含量的變化,將發酵過程劃分為4個階段:發酵初期、發酵前中期、發酵中后期和發酵末期。發酵初期包括第0天和第2天,此階段大多數香氣成分含量最低,只有壬酸、正己醇、丙醇、α-松油醇和里那醇的含量較高。發酵前中期為發酵第4天,此階段大多數香氣成分的含量明顯升高。發酵中后期包括第6天和第8天,此階段大多數香氣成分的含量進一步提高,但壬酸、正己醇和里那醇的含量降低。發酵末期包括第10天和第12天,此階段大多數香氣成分的含量進一步升高,并達到最大值,但壬酸、己酸甲酯、正己醇、丙醇和己酸異戊酯的含量降低。正己醇和丙醇在在發酵前中期含量最高,在發酵末期含量降低,這是因為正己醇主要在發酵前中期,由來自葡萄皮的脂肪酸前體經酶促和化學氧化形成,不在發酵過程中產生[20],并且不斷與乙酸發生反應,生成了乙酸己酯;丙醇只能由蘇氨酸通過轉氨作用產生,當葡萄汁中的可同化氮耗盡時,丙醇便不再產生,且隨著發酵的進行不斷散失[21]。

圖1 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵時間聚類熱圖

2.2 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣成分總量變化

本研究共檢測出47種香氣成分,可分為酯、高級醇、脂肪酸、類異戊二烯和醛酮類5個類別。為研究‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣成分總量變化,將所有香氣成分的含量相加,做成堆積柱狀圖,如圖2-a所示,香氣成分總量在發酵初期最低,在發酵前中期和中后期迅速增加,在發酵末期達到最大值,與MORAKUL等[22]的研究結果一致。

a-香氣成分總量;b-香氣成分比例

在‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中,不同種類香氣成分的含量比例在不斷變化,如圖2-b所示,發酵第0天,高級醇比例最高,為79%;從發酵第2天至發酵結束,高級醇比例降低,且趨于穩定;酯類比例呈先增加后降低的趨勢;脂肪酸比例呈遞增趨勢,在發酵結束時達到最高;醛酮類和類異戊二烯的占比較低,都低于1%。

2.3 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中不同種類香氣成分含量變化

為進一步研究‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中不同種類香氣成分含量變化,繼續將酯、高級醇、脂肪酸、類異戊二烯和醛酮類物質的含量做成堆積柱狀圖。

如圖3-a所示,發酵第0天,酒樣中酯類物質含量最低,隨著發酵的進行,酯類物質的總量遞增,發酵第10天時,達到最大值,發酵結束時降低,與胡博然[23]的研究結果一致。月桂酸乙酯、癸酸乙酯等大多數乙酯的含量遞增,并在發酵結束時達到最大值,但辛酸乙酯、己酸乙酯的含量在發酵結束時降低;同時乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等乙酸酯的含量均在發酵結束時降低。酯類物質中含量最高的是乙酸異戊酯。

a-酯類總量;b-高級醇類總量;c-脂肪酸類總量;d-類異戊二烯類總量;e-醛酮類總量

葡萄酒中酯類物質的釋放與平衡分配系數(Ki值)呈正相關性,Ki值主要受溫度和葡萄汁成分的影響[24]。發酵末期,酯類物質生產速率降低,生成量減少;并且在發酵末期,酒液中酯類物質濃度逐漸積累到一個最大值,使Ki值不斷增大,增強了香氣物質的揮發性,最終致使散失量大于生成量,導致發酵結束時酯類物質總量降低。

如圖3-b所示,發酵第0天,酒樣中高級醇類物質的總量最低,隨著發酵的進行,其總量遞增,發酵結束時達到最大值,與MOURET等[21]的研究結果一致。正己醇、丙醇的含量在發酵前期含量最高,隨后逐漸降低;正丁醇的含量在從第2天開始保持相對穩定;2,3-丁二醇和異丁醇的含量一直遞增,并在發酵結束時達到最大值;異戊醇、苯乙醇的含量在發酵第8天達到最大值,發酵結束時略有降低。高級醇類物質中含量最高的是異戊醇。

如圖3-c所示,在發酵第0天,脂肪酸類物質的總量最低,隨著發酵的進行,逐漸升高,發酵結束時達到最大值,與KONG等[25]研究結果一致。在脂肪酸類物質中,只有乙酸的含量遞增,其余脂肪酸的含量在發酵第8天達到最大值后,均在發酵結束時降低。脂肪酸類物質中含量最高的是乙酸。

葡萄酒中游離態的類異戊二烯來自糖苷態類異戊二烯的水解。糖苷態類異戊二烯的水解有兩種方式,一是由釀酒酵母產生的糖苷酶的酶解作用,二是在釀造環境下的酸水解。在發酵過程中,葡萄糖的濃度逐漸降低,糖苷酶受到葡萄糖的抑制作用逐漸減弱,活性增強[26];并且隨著酒精發酵的進行,整個發酵體系的pH不斷降低,酸水解的作用也不斷增強[27],最終使類異戊二烯物質的總量在發酵結束時達到最大值。

如圖3-e所示,醛酮類物質在發酵第0天含量最低,隨著發酵的進行逐漸升高,在第6天達到最大值,隨后呈遞減趨勢,與胡博然[23]的研究結果類似。

2.4 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣特征變化

在發酵過程中,會產生大量的香氣物質,當香氣物質的OAV>1時,便會對葡萄酒的香氣特征產生影響[28]。表1是‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣物質OVA表,圖4是‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣特征雷達圖,可以看到,葡萄汁的香氣特征以甜香為主。葡萄汁中只有己酸、α-大馬士酮和癸醛的OAV>1,葡萄汁的甜香香氣特征可能與與α-大馬士酮和癸醛有關。

表1 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中OAV

圖4 ‘霞多麗’干白葡萄酒發酵過程中香氣特征雷達圖

發酵第2天,乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙醇、苯乙醇、己酸、辛酸的OAV>1,使酒樣出現香蕉、蘋果、梨、菠蘿、蜂蜜的香氣特征,柑橘香氣特征的出現可能與癸醛有關。發酵第4天,除上述香氣成分外,新增OAV>1的有丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和異丁醇,使酒樣的蘋果、桃子的香氣特征增強,并且上述其他香氣特征也隨著香氣成分含量的增加進一步增強。酒樣的柑橘、檸檬香氣特征增強,可能與香葉醇和香茅醇的生成有關。發酵第4天,琥珀酸二乙酯的OAV>0.5,雖然<1,但可能與其他香氣成分共同起作用,使酒樣的甜瓜香氣特征增強。

從發酵第6天到第10天,除上述香氣成分外,2,3-丁二醇和癸酸從第8天開始OAV>1,分別給酒樣帶來果香和脂肪味,堅果香氣特征增強可能與癸酸有關。酒樣的蘋果、香蕉、梨、菠蘿、甜瓜、柑橘、檸檬、蜂蜜的香氣特征評分隨著丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯、異戊醇、苯乙醇、香茅醇的含量在發酵第8天或第10天達到最大值。

發酵第12天,2,3-丁二醇、癸酸乙酯的OAV繼續增加,上述酯、高級醇和脂肪酸類物質的OAV均降低,導致蘋果、香蕉、梨、菠蘿、甜瓜、蜂蜜、柑橘、檸檬、堅果的香氣特征評分降低。月桂酸乙酯的OAV>1,可給酒樣帶來花香,洋槐花香氣特征評分在第12天到達最大值,可能與月桂酸乙酯有關。

3 結論

在‘霞多麗’干白葡萄酒的發酵過程中,根據香氣成分含量的變化,可將發酵過程分為發酵初期、發酵前中期、發酵中后期和發酵末期4個階段。隨著發酵的進行,香氣成分總量呈遞增趨勢,并在發酵結束時達到最大值;高級醇、脂肪酸、類異戊二烯類物質的總量呈遞增趨勢,在發酵結束時達到最大值;酯類物質總量在第10天達到最大值,在發酵結束時略有降低;醛酮類物質總量在第6天達到最大值,隨后逐漸降低。葡萄汁的香氣特征以甜香為主,隨著發酵的進行,出現了梨、蘋果、桃子、甜瓜、菠蘿、香蕉、柑橘、檸檬、蜂蜜、堅果和洋槐花的香氣特征并逐漸增強;桃子、甜瓜、蜂蜜、堅果、柑橘的香氣特征在發酵第8天到達最大值,梨、蘋果、菠蘿、香蕉、檸檬的香氣特征在發酵第10天到達最大值,洋槐花的香氣特征在發酵結束時到達最大值。