基于優化的高效液相色譜法測定蜜餞中七種人工合成色素及風險分析

肖杰,蘇明,鐘宇思,王詠麟,李玉寶

(四川省輕工業研究設計院有限公司,四川 成都,610081)

蜜餞類食品作為一種典型的果蔬類干制品,因其口感香甜、食用方便、色彩斑斕的視覺刺激以及一定的保健功效等特性而備受喜愛,已成為人們茶余飯后、約會待客的休閑食品[1]。為進一步改善蜜餞的色澤,一些食品生產商通常會在蜜餞的腌制過程中加入著色劑,即色素[2]。色素可分為天然色素和人工色素,天然色素一般提取自新鮮的水果或蔬菜等[3],具有生理活性高、吸收效率好、健康威脅低等特點[4],但其制作成本高,且穩定性較差[5]。人工合成色素主要是以苯、甲苯、萘等化工產品為原料,經過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列有機反應化合而成[6],易實現大批量生產,具有成本低廉、著色能力強、抗氧化和抗酸堿性好、性質穩定等優勢,已在食品加工工藝中廣泛使用[7-8]。但是,人工合成色素的過量攝入會引起DNA損傷、代謝紊亂、行為異常等不良生長發育后果,進而誘發神經、心血管系統等多種疾病,具有致癌、致畸、致突變的“三致”作用[9]。研究表明,某些偶氮類色素經人體新陳代謝后會轉變成萘胺類致癌物質[10-11]。因此,國內外管理部門對人工合成色素的使用范圍和添加量都做了明確而嚴苛的限值規定[12-13],如GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》。然而,為使蜜餞的色澤愈發博人眼球而達到牟取更多利潤的目的,一些食品生產商仍在蜜餞的制作過程中非法添加過量的人工合成色素。因攝入過量的人工合成色素而導致的食品安全事故頻發,為確保食品安全和維護人體健康,對蜜餞類食品中人工合成色素的高效檢測以及安全風險評估至關重要。

迄今為止,食品中人工合成色素的檢測方法主要有示波極譜法[14]、電化學法[15-16]、薄層色譜法[17]、毛細管電泳法[18]、高效液相色譜法[19-20]、高效液相色譜-串聯質譜法[21-23]、分光光度法[24]等。這些分析方法各有利弊,如示波極譜法具有操作簡便、靈敏度高的優點,但其需在特定的緩沖溶液中進行測定,且只能對目標物之間不存在相互干擾的合成色素體系進行定量分析[25];高效液相色譜-串聯質譜法在定性和定量分析中表現出極高的靈敏度和準確度,但因儀器設備昂貴、體積龐大、操作難度高等特點而在普適性方面面臨巨大挑戰。高效液相色譜法具有靈敏度高、重現性好、操作簡單、儀器價格適中以及普適性高等性質,是GB/T 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》中推薦使用的檢測技術。然而目前利用高效液相色譜法檢測蜜餞類食品中人工合成色素的研究較少,且其檢測效率也有待進一步提高。因此,基于高效液相色譜法實現對蜜餞類食品中多種人工合成色素的高效檢測以及進一步開展風險評估極具探究意義。

鑒于此,本研究以蜜餞中7種人工合成色素(檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅)為研究對象,基于GB/T 5009.35—2016中的高效液相色譜技術進行了方法優化,包括提取、凈化以及檢測方式3個方面,顯著提高了分析效率,成功實現蜜餞樣品的大批量檢測。本研究進一步對成都及周邊地區市售多批次蜜餞類樣品進行了檢測,并開展了風險評估分析,研究表明蜜餞樣品中人工合成色素的檢出率較高,且過量添加人工合成色素的現象依然存在,因而亟需加強市場監管。本研究構建的方法具有準確度和靈敏度高、操作簡單、普適性強、利于大批量樣品的高效檢測等特性,結合風險評估分析,可為政府管理部門的監管工作提供科學依據,以期為人體健康保駕護航。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中的565批次蜜餞類樣品均隨機采購于成都及周邊地區的批發市場、農貿市場、大型商場等。

標準品:檸檬黃(1 000 μg/mL),曼哈格科技公司;莧菜紅、胭脂紅(1 000 μg/mL),北京壇墨質檢科技有限公司;日落黃(500 μg/mL),上海安譜實驗科技有限公司;誘惑紅、酸性紅(1 000 μg/mL),北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司;亮藍(500 μg/mL),中國計量科學研究院;甲醇(色譜純),安徽時聯特種溶劑股份有限公司;無水乙醇、乙酸銨、檸檬酸、甲酸(分析純),成都科隆化學品有限公司;氨水(25%),廣東光華科技股份有限公司;聚酰胺固相萃取柱(500 mg/6 mL),逗點生物科技有限公司;聚酰胺粉(200目),國藥集團化學試劑有限公司;0.45 μm水系濾膜(聚醚砜),天津市津騰實驗設備有限公司;0.45 μm有機系濾膜(尼龍),天津市津騰實驗設備有限公司;一級水;G3垂融漏斗。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜儀(配置二極管陣列檢測器),美國Thermo Fisher Scientific公司;BSA223 s電子天平(感量0.001 g),賽多利斯科學儀器有限公司;Shimadzu Shim-pack GIST C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5.0 μm),日本島津公司;Milli-Q超純水發生器,美國Millipore公司;FJ300高速均質機,上海標本模型廠;5804R臺式高速離心機,德國eppendorf公司;BC-1000多管渦旋混合儀,逗點生物科技有限公司;410HT數控超聲波清洗器,深圳市潔拓超聲波清洗設備有限公司;N1-50多孔氮吹儀,屹堯科技有限公司;MJ-PT51破壁機,美的電器股份有限公司;HH-8電熱恒溫水浴鍋,北京中興偉業儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑的配制

配制5%(體積分數)氨水溶液、60%(體積分數)甲醇溶液、0.02 mol/L乙酸銨溶液、1.0 mol/L檸檬酸溶液、甲醇-甲酸混合溶液(6∶4, 體積比);無水乙醇-氨水混合溶液[無水乙醇、5%(體積分數)氨水溶液和水按體積比7∶2∶1混勻]、甲醇-氨水混合溶液[甲醇和25%(體積分數)氨水按體積比9∶1混勻]。

1.3.2 標準溶液的配制

混合標準中間液:分別準確移取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅標準溶液至25 mL容量瓶中,加水定容至刻度,配制成質量濃度為50 μg/mL的混合標準中間液。

混合標準工作液:分別準確移取上述步驟中的混合標準中間液,加水稀釋后,配制成質量濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的系列標準工作液。

1.3.3 樣品的檢測

1.3.3.1 樣品前處理

當蜜餞類樣品無核時,則可直接用破壁機進行破碎處理;若蜜餞類樣品有核,則應先去其核,再取其可食用部分經破壁機進行破碎處理。然后,稱取5 g破碎后的樣品至50 mL離心管中,加入20 mL無水乙醇-氨水混合溶液,經高速均質機均質,于60 ℃水浴下超聲提取5 min,最后經離心處理。重復上述提取步驟2次,合并提取液,將其經水浴揮發至小于10 mL后,用檸檬酸溶液調節pH值至3.0～4.0,待后續凈化處理。

1.3.3.2 樣品凈化

采用聚酰胺固相萃取柱法進行樣品的純化。聚酰胺固相萃取柱先分別用5 mL甲醇和5 mL水進行活化,再將待凈化樣品全部轉移至小柱上,控制流速低于2 mL/min, 于60 ℃下分別用10 mL水(pH=4)和10 mL甲醇-甲酸混合溶液淋洗小柱,再用10 mL水沖洗柱體,抽干后用10 mL甲醇-氨水混合溶液進行洗脫。收集洗脫液,于60 ℃水浴下用氮氣吹至近干狀態,再用60%(體積分數)甲醇溶液定容至 5 mL,最后經0.45 μm水系微孔濾膜過濾后用高效液相色譜儀進行分析。

1.3.3.3 樣品檢測條件

色譜柱:Shimadzu Shim-pack GIST C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);流動相:甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液;流速:0.7 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL;檢測波長:428 nm,帶寬4 nm,步長0.2 s。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.4 數據處理

本研究所采用的數據均以上機測試而來的原始數據為基礎,平行試驗數據取平均值,數據用Microsoft Excel軟件處理,在Origin軟件中進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 提取方法的優化

本研究在對蜜餞樣品進行前處理的過程中發現,若直接采用GB/T 5009.35—2016中的提取方法對蜜餞樣品進行處理,即僅使用純水作為樣品的提取液,樣品中人工合成色素的提取不充分且效率極低,進而導致分析結果嚴重偏低(表2),并且還會使樣品呈渾濁的黏稠狀態,即使在抽濾的條件下也難以將提取液分離出來。簡言之,該方法操作步驟繁瑣、提取效率較低、可行性不高,難以適用于應急檢測或者大批量樣品檢測。鑒于此,本研究對蜜餞樣品的提取溶劑和提取步驟進行了優化。本文中7種人工合成色素均為苯磺酸鈉結構,一般地,含有酸性基團的色素更容易被堿性溶液提取。因此,本研究以無水乙醇/氨水堿性混合溶液作為蜜餞樣品的提取液,其具體實施步驟為:將樣品在60 ℃條件下進行超聲提取,經離心后得到澄清的樣品溶液。研究表明,優化后的提取方法可有效實現樣品混合物的固液分離,并展現出較高的多組分人工合成色素提取效率,各組分的回收率也得到了顯著提升,如表2所示。該方法使得后續的凈化處理過程更加便捷,同時也為批量蜜餞樣品的檢測提供了保障。

表2 兩種不同提取溶劑的提取效果及回收率

2.2 凈化方法的優化

在實驗過程中,首先根據GB/T 5009.35—2016中的凈化方法即聚酰胺粉吸附法對上述提取的樣品溶液進行處理,但該凈化方式需要大量的洗脫液,使得后續蒸發濃縮處理步驟耗時較長。該法不符合綠色化學的理念,也不利于批量蜜餞樣品的高效檢測。為了減少對環境不友好的有機試劑或藥品的使用量以及提高檢測效率,本研究提出一種基于聚酰胺固相萃取柱的高效凈化方式,將提取的樣品溶液經活化的聚酰胺固相萃取柱處理后,先用甲醇-甲酸混合溶液沖洗天然色素,再用甲醇/氨水混合溶液進行洗脫,然后氮吹至近干,溶解定容,最后經水系微孔濾膜過濾后上機檢測。對比2種凈化方法發現,雖然其定量分析結果沒有顯著性差異,但是本研究采用的基于聚酰胺固相萃取柱的凈化方法更為簡單便捷,且耗時較少,有利于實現大批量蜜餞樣品的高效檢測。

此外,在本研究所提出的方法中,樣品溶液經水系微孔濾膜過濾后再上機檢測。對水系微孔濾膜和有機系微孔濾膜的色素透過率進行了對比,如圖1所示。研究表明,水系微孔濾膜對色素展現出更好的透過性能,其透過率接近100%,對7種人工合成色素均無明顯吸附。

圖1 不同濾膜對7種人工合成色素的吸附影響

2.3 檢測波長的優化

GB/T 5009.35—2016中采用紫外光區的254 nm作為人工合成色素的檢測波長,各組分的響應值均較高,但在此紫外波長下的目標物檢測容易受到其他因素干擾,如一些雜質也可在此紫外波長下產生吸收,導致出現假峰的可能性較高,從而影響檢測結果的準確性。為提高目標物質檢測的抗干擾能力,增加檢測結果的準確性,選擇可見光區的檢測波長是一種有效的解決方式。本研究首先對7種人工合成色素進行了全波段掃描,其定性光譜圖如圖2所示,據此選擇428、508、625 nm 3種代表性檢測波長開展后續實驗。

a-檸檬黃;b-莧菜紅;c-胭脂紅;d-日落黃;e-誘惑紅;f-亮藍;g-酸性紅

本研究進一步對比了樣品中各人工合成色素組分分別在428、508、625 nm 3個檢測通道下的響應強度,如圖3所示。在508 nm波長下,莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅以及酸性紅的響應值較高,但檸檬黃和亮藍的響應值非常低;在625 nm波長下,亮藍具有極高的響應值,但其余組分幾乎無響應;而在428 nm波長下,各組分均展現出優異的響應性能,其中檸檬黃的響應強度最高,并且各色素具有良好的分離性能,如表3所示。綜合考慮抗干擾能力、檢測準確性、檢測效率以及便捷性等因素,本研究選擇可見光區的428 nm作為后續實驗的檢測波長。

1-檸檬黃;2-莧菜紅;3-胭脂紅;4-日落黃;5-誘惑紅;6-亮藍;7-酸性紅

表3 七種人工合成色素的保留時間和分離度

2.4 線性范圍與檢出限

以各分析物的質量濃度X(μg/mL)和峰面積Y(μAU)分別為橫、縱坐標繪制標準工作曲線,得到的回歸方程和線性相關系數如表4所示。各組分均在0.1～50 μg/mL質量濃度內具有良好的線性關系,線性相關系數均在0.999 0以上。本研究進一步以國標要求的最低檢出限0.2 mg/kg作為本方法檢出限的考察標準,如圖4所示,各人工合成色素組分均展現出明顯的響應。因此,本研究所構建的分析方法完全能滿足國標的檢測要求。

圖4 空白樣品加標回收色譜圖(0.2 mg/kg)

表4 蜜餞樣品中7中人工合成色素檢測方法的線性關系、回收率和精密度

2.5 回收率與精密度

選取各色素組分均未檢出的陰性樣品分別做3倍、10倍、20倍檢出限濃度水平的加標實驗,同時加入7種色素,每個濃度水平平行進行3次試驗。7種人工合成色素的回收率范圍和相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)結果見表4,表明本方法具有較好的分析性能。

2.6 風險分析

基于本研究建立的方法對成都及周邊地區隨機購買的蜜餞類樣品(共計565批次)進行人工合成色素檢測,包括烏梅、半邊梅、情人梅、金桔、獼猴桃干、地瓜干、冬瓜條、桑葚干等,其檢測結果詳見表5。除誘惑紅和酸性紅外,檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍均有不同程度的檢出。亮藍的檢出率較低,僅為0.53%。然而,檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃的檢出率普遍偏高,其檢出率分別達到35.0%、9.4%、20.0%、47.3%,尤其是檸檬黃和日落黃較為顯著。特別地,仍有10批次不合格蜜餞樣品超過GB 2760—2014中的限值規定,其不合格添加的色素主要是莧菜紅、胭脂紅、日落黃。

表5 批量蜜餞樣品中人工合成色素的檢出情況

商家違規添加人工合成色素主要是為了改善蜜餞的色澤,以激發消費者的購買欲。本研究共檢測400余批次梅子類蜜餞如烏梅、半邊梅、情人梅等,其人工合成色素檢出率高達60%;其他種類的蜜餞如獼猴桃干、地瓜干、冬瓜條、桑葚干等食品共檢測100余批次,其人工合成色素的檢出率較低,約為14.0%。值得注意的是,很多蜜餞樣品中往往不止添加一種人工合成色素,如半邊梅中就同時檢出了檸檬黃和日落黃,如圖5所示。一些商家會采取按需調配的方式,在蜜餞食品的制作過程中同時添加多種人工合成色素,這些蜜餞食品的表面更加光滑,色澤也更為艷麗,更易受到消費者的青睞。

圖5 實際樣品檢測色譜圖

此外,本研究檢測出10批次超限量添加的不合格蜜餞樣品,其中1批次為金桔,超標項目為胭脂紅;其余不合格9批次均為烏梅,超標項目分別為莧菜紅(6批次)、胭脂紅(2批次)和日落黃(1批次)。研究表明,蜜餞類食品中人工合成色素的檢出率較高,且存在違規添加的現象。過量食用蜜餞食品會對身體健康造成威脅,因而加強市場監管對于確保食品安全以及維護人體健康具有重要意義。

3 結論與討論

本研究以蜜餞類食品中7種人工合成色素為研究對象,從樣品提取、凈化和檢測方式進行了方法優化,建立了一種適用于批量樣品中多種人工合成色素同時檢測的高效液相色譜分析技術。結果表明,該方法具有準確度和靈敏度高、線性關系良好、操作便捷、普適性強等特點,其檢出限為0.2 mg/kg,相關系數均在0.999 0以上,平均回收率和RSD分別為82.1%～96.6%和3.71%～8.35%。此外,本研究進一步基于該方法對來自成都及周邊地區多批次市售蜜餞類樣品進行了檢測,研究表明,人工合成色素在蜜餞類食品中頻繁檢出,且過量添加現象依然存在,因此為保障人體健康,加強市場監管具有重要意義。