冒煙型多發性骨髓瘤的生物學特征研究

徐嘉軒 董曉慶 陳兵

冒煙型多發性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)是一種介于意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)和活動性多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)間的無癥狀惡性克隆性漿細胞疾病[1]。國際骨髓瘤工作組(IMWG)將真正的惰性骨髓瘤定義為SMM,其診斷標準為血清M蛋白≥3 g/dL或24 h尿本周蛋白≥500 mg,和(或)骨髓克隆漿細胞比例為10%～60%,且無骨髓瘤定義事件或淀粉樣變[2]。SMM病人是一類高風險亞群,其進展為活動性MM的比例較高且不均勻,診斷后前5年內進展風險約為每年10%[3-4]。梅奧診所提出的風險分層表明,SMM可根據骨髓漿細胞比例、M蛋白及血清游離輕鏈比值劃分出低、中、高三類風險等級,其中位進展時間分別為110、68、29個月[5]。

目前SMM進展風險與疾病相關的臨床指標有關[6],因此通常能夠識別出小部分將要或者已經進展為MM階段的病人。但由于MM生物學的高度異質性,僅靠現有的疾病臨床因素鑒別出進展傾向或高危病人仍然不夠全面和準確,因此深入闡明SMM內在的生物學特性尤為必要。基因芯片、下一代測序(next-generation sequencing, NGS)和單細胞測序等技術的應用為識別SMM基因組學及免疫學特征提供了平臺支撐[7-8],有助于揭示骨髓瘤的克隆進化模式和進展分子機制,為臨床評估SMM的進展風險提供更全面的手段。

1 細胞遺傳學

細胞遺傳學異常是SMM進展風險升高的重要因素,免疫球蛋白熒光原位雜交(FISH)作為染色體異常的常用臨床檢測技術,用以明確SMM病人中細胞遺傳學異常的分布特點及其對進展預后的影響。Lopez-Corral等[9]的研究表明,SMM發生del 13q的比例(61%)低于MM(74%),高于MGUS(37%),發生t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)、del 17p以及gain 1q等事件的比例也均介于MGUS與MM之間,且差異均具有統計學意義。這證實了骨髓瘤疾病進程中涉及到明顯的遺傳學異常漿細胞的克隆擴增,SMM則處于MGUS至MM克隆演變的中間過渡態。Rajkumar等[10]對351例SMM病人進行FISH分析表明,36.2%的病人存在免疫球蛋白重鏈(IGH)易位,發生IGH易位的病人中最常見的為t(11;14)(57例),其次為t(4;14)(36例)。與t(11;14)病人相比,t(4;14)病人向MM進展的中位時間明顯更短(28個月比55個月),診斷為SMM后的中位生存時間也較短(105個月比147個月)。另外,del 17p也與進展時間縮短顯著相關,其與t(4;14)均被認為是SMM細胞遺傳學高風險因素。

基于診斷為SMM時及進展為MM后的配對樣本縱向分析則更能反映骨髓瘤進程中克隆演化及亞克隆的影響。Merz等[11]開展縱向隊列FISH分析強調了t(4;14)、del 17p、del 8p、del 13q以及gain 1q與更高的進展風險顯著相關,并且這些細胞遺傳學異常作為主克隆而非亞克隆時對預后的影響更加明顯,其作為亞克隆遺傳學異常也同樣具有預后意義,尤其在高危SMM中更為顯著。另一項縱向研究觀察到SMM進程中出現新的細胞遺傳學事件如del 13q、del 17p以及t(14;16)[12],驗證了疾病過程中的克隆進化,并強調了在SMM階段實施FISH檢測的重要性。

2 基因表達譜

由于SMM進展到MM的生物學過程非常復雜,目前未能明確用來區分MM各階段的特異性生物標志物,進展過程中涉及的信號通路和分子機制也尚未被完全了解?；诨虮磉_譜的生物信息學分析能夠描繪功能通路富集特點、鑒定轉錄因子調控網絡及建立風險預測模型,從而加深對疾病特性基因層面的認知。

轉錄組通路網絡分析表明,與正常樣本相比,SMM的差異基因數目明顯少于MM,提示SMM擁有較為惰性的生物學功能狀態,MM所涉及的通路富集更為復雜[13]。SMM差異基因中包括MAFB和HIF1A這兩個轉錄因子,前者與許多SMM進展相關基因存在互作關系;而進展后的MM差異基因網絡中包含26個轉錄因子,提示MM比SMM擁有更復雜的轉錄調控特性。進一步的,差異基因功能富集分析表明,SMM擁有覆蓋且超過MGUS涉及的基因本體(GO)富集結果,表明SMM存在著與MGUS相似的生物學特性而又演化出新的功能通路,其中SMM最顯著的GO類別是主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類受體,其他還包括蛋白復合物結合、細胞因子結合、激酶結合和蛋白二聚化活動;而MM顯著富集的GO類別則與SMM存在著較大差異,其主要包括RNA結合、酶結合和結構性DNA結合等。

經基因共表達網絡鑒定及拷貝數變異分析驗證后得到4個SMM特征性的轉錄因子標志物[14],分別是MYC相關因子X(MAX)、鋅指蛋白148(ZNF148)、轉錄因子4(TCF4)和ZNF281。MAX是MYC轉錄調控有關的復合物,其在SMM進程中拷貝數變異下調,被認為是MM中的腫瘤抑制基因[15];ZNF148在從正常到MGUS再到SMM的進程中拷貝數變異和基因表達量均逐漸上升,可能作為SMM早期診斷的潛在標志物,其也是MM轉錄調控網絡特征中的重要一員[13];模塊富集分析結果提示,ZNF281在SMM中轉錄基因更加活躍,更有利于引起DNA突變從而促進骨髓瘤細胞的增殖及惡性演變,而TCF4則在MGUS驅動過程中更為活躍。這4個轉錄因子在SMM發展進程中具有很強的生物學相關性,后續可開展功能實驗深入驗證其在體內外的重要作用。

有研究表明,從惰性骨髓瘤到MM的轉變過程中,炎癥及細胞因子/趨化因子信號通路是最為顯著的調控通路,進而根據B細胞/漿細胞介導的免疫過程相關基因鑒定出一個多基因評估模型,其能夠準確區分SMM和癥狀性MM的進程狀態,有助于在基因表達層面評估SMM病人的分子學特征[16]。此外,一個結合臨床特征的四基因評分模型(GEP4)被用來預測SMM進展為癥狀性MM的風險概率[17]:GEP4模型高評分病人2年進展為MM的概率為85.7%;而GEP4模型低評分、基線M蛋白<3 g/dL和白蛋白≥3.5 g/dL所共同確定的低風險SMM群體2年進展為MM的概率僅為5.0%。

3 基因組測序

既往關于SMM的基因組特征及其向MM進化模式的研究甚少,尤其是進展為MM過程中全基因組突變譜的變化差異尚不清楚。近年來,NGS技術尤其是全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)的應用提供了對骨髓瘤基因組編碼區突變景觀的全面刻畫[18],識別出各種關鍵的MM驅動事件及其產生的分子學演變模式,并能預估疾病進展過程中各類驅動因素出現的時間序列[19],從而顯著提升了對骨髓瘤發生與進展基因組學層面的認知。

SMM基因組圖譜與MM具有相似的遺傳學組成,如突變位點和結構重排,也具有相似的突變密度和克隆異質性[20-21]。SMM基因組的復雜性相當高,其復雜性與疾病進展時間或演化頻率似乎無關。短時間內進展的高危SMM病人其轉化條件并不總是依賴額外突變或克隆選擇的獲得,而可能是在外部因素的驅動下憑借基因組的復雜性達到向MM轉化的閾值,這種轉化進展可能與獲得性突變模式的改變有關,而非突變總負荷的積累增加[20,22]。

SMM進展過程中的主要特征是克隆穩定性,一些常見的染色體異常如del 13q、超二倍體及IGH易位等均是克隆性的;常見的驅動突變如KLHL6、TP53及MAX等大多數也是克隆性的,可能在疾病早期獲得并驅動克隆拓展。對于亞克隆而言,SMM具有顯著的亞克隆異質性,且在進展時容易受干擾,例如骨髓微環境中存在的強大選擇壓力能定義克隆結構,進而在亞克隆演化和疾病進展中發揮關鍵作用。少數體細胞拷貝數變異如del 1p和del 17p是亞克隆性的,MM常見驅動事件相關的單核苷酸變異主要也是亞克隆的,表明它們是在疾病進展的后期獲得的[20-22]。

研究表明,在SMM診斷時,大部分的遺傳改變異常已經發生,即大多數病人的基因組成很大程度上取決于SMM的診斷時間,因此基于SMM診斷時發現的生物標志物能夠作為基因組預測因子,以區分易于進展的高風險SMM病人[21,23]。KRAS、NRAS及FAM46突變是顯著的進展風險因素[21],尤其是KRAS突變與更短的進展時間顯著相關[24-25]。KRAS突變影響著細胞周期進展從而促進克隆清除和MM轉化,攜帶KRAS突變的SMM病人更適合被定義為過渡進程中的MM[24]。信號通路突變層面,MAPK通路及DNA修復通路相關基因的突變與SMM進展風險相關[21];而與初診MM病人相比,高危SMM病人NF-κB通路基因突變頻率較低[26]。值得注意的是,活化誘導的胞苷脫氨酶對早期亞臨床階段突變格局的形成起著重要作用,載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(APOBEC)能夠驅動SMM進程且其活性隨著疾病進展而提升,APOBEC相關突變在SMM進展病人中顯著富集并與更短的進展時間相關[20-21,24]。此外,MYC異位或擴增作為關鍵的基因組結構突變事件,是SMM進展的獨立危險因素,對預測骨髓瘤進展具有重要價值[21,24,27]。

基于WGS技術對SMM進展前后配對樣本的全基因組分析能夠識別出不同的生物學進展模式,從而深刻揭示SMM惡性轉化的生物學基礎。Bolli等[20]提出SMM進展的兩種不同模式,第一種是靜態進展模型,疾病進展到MM時相同的亞克隆結構保留,進展僅反映了從積累足夠的疾病負荷到出現臨床癥狀所需的時間,進展時間通常小于1年;第二種是自發進化模型,SMM亞克隆組成在缺乏任何來自治療的選擇壓力下發生了變化,反映了形成一個真正的新惡性克隆并進展到明顯MM所需的時間,其中位進展時間比第一種模型更長。Oben等[28]也證明WGS技術可用于識別兩種生物學特征截然不同的SMM實體,即穩定型和進展型,兩者在骨髓瘤基因組事件如驅動基因突變、染色體多態性、拷貝數變異及典型APOBEC突變活性等方面存在顯著的差異。穩定型病例高危遺傳事件負擔較低,臨床病程呈惰性且進展慢,較晚發生或缺少骨髓瘤定義的基因組事件;而進展型病人則較早發生或有足夠數量的上述事件,惡性潛能高且進展快。

4 免疫微環境

免疫微環境失調是骨髓瘤重要的生物學特性,骨髓微環境中的漿細胞外在因素在疾病進展和治療效果中起著關鍵作用[29]。骨髓瘤的發生與發展密切依賴于惡性漿細胞與骨髓免疫環境細胞成分間的交互作用,引起骨質破壞和免疫系統受損等,進而促進疾病進程、復發和耐藥產生[30]。通過免疫表達譜、單細胞測序及流式細胞術等能夠鑒定SMM的免疫微環境特征,有助于識別出高進展風險的SMM病人并開發新的免疫靶向療法。

Isola等[31]的研究表明,與MGUS和MM相比,SMM中細胞毒性相關基因的表達明顯上調,其中部分細胞毒性分子與抑制性免疫檢查點如淋巴細胞激活基因3(LAG3)、T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制性基序結構域(TIGIT)等表達呈正相關,可能損害骨髓細胞毒性T細胞的效應功能以及削弱抗骨髓瘤的免疫反應。進一步地,基于免疫成分和激活標志物表達譜聚類分析得到4個不同的亞群,其中亞群2病人細胞毒性分子如GZMB、GNLY、IFNG等表達較高,提示耗竭的細胞毒性T細胞水平較高,這類SMM病人的無進展生存期顯著更短。該研究發現的高危SMM病人存在部分抑制性免疫檢查點如TIGIT和LAG3表達上調也得到了單細胞測序結果的支持[32],后續可深入評估其作為阻遏SMM進展的免疫治療靶點的應用潛力。另一方面,配對基因表達分析表明,與活動性MM相比,SMM階段某些腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員如CD137、TNFAIP3、TNFRSF14等表達水平高,且與病人更短的無進展生存期顯著相關,提示促炎微環境的形成可能促進骨髓瘤的進展[31]。因此,細胞毒性T細胞衰竭和慢性炎癥可能是SMM中免疫失調導致漿細胞惡性進化的部分機制解釋。

此外,Paiva等[33]發現高危SMM病人較健康對照者,免疫狀態輕度受損,1型T輔助細胞及γδT細胞數量顯著更少,使用來那度胺治療這些高危病人后,其功能性活性T淋巴細胞數量得到提升,NK細胞表型發生顯著變化,表明治療性免疫調節能通過激活受損的免疫系統以延緩SMM進展。Zavidij等[32]觀察到SMM階段即出現調節性T細胞的早期積累,隨后GrK(+)記憶細胞毒性T細胞種群喪失,后者在小鼠模型骨髓瘤免疫監測中起關鍵作用;同時也觀察到SMM期間IFN信號通路強度升高,暗示涉及IFN通路的復雜調控網絡在高危SMM階段可能已經存在,有望成為預防SMM進展的干預靶點。Fernandez等[34]對73例SMM病人骨髓標本利用蛋白組學、血清組學及T細胞受體測序的綜合方式進行高維免疫分析,鑒定出3個穩定的免疫分類亞群,并明確了骨髓血漿多效蛋白和骨髓T細胞水平的差異是這些免疫類群間的重要區分因素,這更加證實了骨髓瘤細胞和免疫微環境間復雜的相互作用導致SMM最終進展的可能性。

5 結語

SMM的生物學特征復雜且多樣,不僅取決于惡性漿細胞本身的基因組遺傳學特征,也受細胞外在因素如免疫微環境的影響。借助各類基因學或免疫學技術能夠深刻揭示SMM疾病的生物學特性,有助于根據所鑒定出的特征因素進一步開發并驗證新的風險分層系統,從而精準預測SMM的進展風險并使高危病人從早期治療中獲益。