雌激素對乳腺癌干細(xì)胞增殖、自我更新的作用研究

周勤梅，王 競，喻允伶△

（1. 重慶市銅梁區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402560； 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016）

據(jù)最新統(tǒng)計，乳腺癌已成為全球女性第一大癌癥［1］，發(fā)病率和死亡率均較高。乳腺癌發(fā)生與環(huán)境、激素、表觀遺傳、基因突變、生活方式等多種因素相關(guān)。目前，針對乳腺癌的主要治療手段有手術(shù)切除及輔助放射治療和化學(xué)藥物治療（簡稱放化療）等。盡管在乳腺癌治療方面已取得很大進(jìn)展，但仍有20%～30%的復(fù)發(fā)/ 轉(zhuǎn)移率［2-3］。因此，繼續(xù)深入研究乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥的分子機(jī)制，尋求乳腺癌早期診斷及治療新靶點具有重要意義。乳腺癌干細(xì)胞（BCSC）是相對于乳腺癌細(xì)胞的獨立細(xì)胞亞群，具有典型的自我更新能力，且可特異性與乳腺癌細(xì)胞表面抗原結(jié)合。本研究團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖及MCF - 7 可誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)，但具體機(jī)制尚未明晰。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是哺乳動物腫瘤免疫中重要的信號通路，在70%惡性腫瘤的癌變過程中發(fā)揮了極重要的作用［4-6］。本研究中驗證了MCF 細(xì)胞具有乳腺癌干細(xì)胞特性，探討不同濃度雌激素對BCSC 的增殖和自我更新作用機(jī)制，以為雌激素用于乳腺癌的臨床治療提供實驗數(shù)據(jù)和新的思考策略。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細(xì)胞

儀器：CX23 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；FLX800 型酶標(biāo)儀（BioTek 公司）；SpectraMax M5 型熒光定量梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（美國MD公司）。

試劑：雌二醇（批號為E8875-1G），聚甲基丙烯酸-2 - 羥乙酯（Poly - HEMA，批號為P3932 - 10G），均購自美國Sigma 公司；DMEM/ F12 培養(yǎng)基（批號為31331093），人白細(xì)胞抗原B27（批號為A1486701）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，批號為13256 - 029）、表皮生長因子（批號為RP-8661），均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；牛血清白蛋白（BSA，批號為A8010），胰島素（批號為I8830），均購自北京索萊寶科技有限公司；Anti - CD44 抗體（批號為ab189524），Anti -CD24抗體（批號為ab202073），均購自Abcam公司。

細(xì)胞：MCF 細(xì)胞系（中國科學(xué)院細(xì)胞庫，編號SCSP-531）。

1.2 方法

1.2.1 BCSC 的培養(yǎng)

取Poly-HEMA 1.2 g，加入95%乙醇，置10 mL 容量瓶，定容，37 ℃搖床溶解過夜，經(jīng)0.22 μm 過濾器濾過，制成體積分?jǐn)?shù)為1.2%的Poly - HEMA；取適量，鋪6孔板，每孔1 mL，超凈工作臺放置過夜；使用前以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗不少于2 遍；每孔加入1 × 104個MCF - 7 細(xì)胞，并加入BCSC 培養(yǎng)基（組成：100 mL DMEM / F12 培養(yǎng)基中加入2 mL 人白細(xì)胞抗原B27、2 μg bFGF、20 μg EGF、0.4 g BSA、500 μg 胰島素和100μL肝素2 mL）培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光實驗

收集上述培養(yǎng)液中懸浮的BCSC（第2代），使用胰蛋白酶消化，置1 mL離心管中，PBS浸洗3 min，1 000 r/min離心5 min，平行3 次；用4%多聚甲醛固定BCSC，室溫過夜，0.5%Triton X-100（以PBS 配制）室溫通透20 min，PBS 浸洗3 min，1 000 r/min 離心5 min，平行3 次，吸干PBS。在離心管內(nèi)加入正常山羊血清，室溫封閉30 min，1 000 r/ min 離心5 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBS浸洗細(xì)胞3 min，1 000 r/min 離心5 min，平行3次，吸干多余液體后滴加熒光二抗（CD24/CD44），暗處孵育1 h；PBS浸洗3 min，1 000 r/min離心5 min，浸洗3 次后，滴加DAPI 染核，避光孵育5 min，PBS浸洗3 min，1 000 r/min離心5 min，平行3 次，吸干多余液體；用含抗熒光淬滅劑的封片液重懸細(xì)胞并封片，置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 BCSC 的生長

采用CCK-8法。將BCSC以1×105/孔密度接種于96 孔板中，每孔分別加入含0，1，5，10，20，100 nmol/L雌激素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，分別于0，24，48，72 h 時以CCK - 8 試劑孵育1 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度（OD）值，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 BCSC 的自我更新

采用Mammosphere形成實驗將BCSC以1×105/孔密度接種于96孔板中，加入含0，10，20 nmol/L 雌激素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長。顯微鏡下觀察孵育48 h 后的BCSC 球形態(tài)，拍照。并統(tǒng)計成球率（細(xì)胞成球標(biāo)準(zhǔn)為緊密的非多細(xì)胞懸浮性球體，直徑大于50μm）。細(xì)胞成球率（%）=細(xì)胞球體數(shù)/每孔所接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)

采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法。以不同濃度（0，1，5，10 nmol/ L）雌激素處理BCSC 24 h 后，提取BCSC 的總RNA，計算RNA 濃度。取1 μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR 法檢測PI3K，AKT，mTOR mRNA的表達(dá)水平。。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCSC 的獲得

經(jīng)連續(xù)2 周培養(yǎng)，從MCF-7 細(xì)胞中成功培養(yǎng)出了BCSC（見圖1），且其中CD44 顯著表達(dá)，而CD24 不表達(dá)（見圖2）。

圖1 乳腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)Fig.1 Culture of BCSCs

圖2 乳腺癌干細(xì)胞的鑒定Fig.2 Identification of BCSCs

2.2 BCSC 的生長情況

與0 nmol/L 比較，1，5，10 nmol/L 雌激素作用下，BCSC 增殖能力顯著升高，且隨著雌激素濃度的升高和作用時間延長，BCSC 的增殖能力逐漸增強(qiáng)；但當(dāng)雌激素濃度大于10 nmol/L 時，BCSC 的生長開始受到顯著抑制（除0 h外，P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 乳腺癌干細(xì)胞的生長情況Fig.3 Growth of BCSCs

2.3 BCSC 自我更新情況

與0 nmol/L 比較，10 nmol/L 和20 nmol/L 雌激素作用下BCSC 體積均顯著增大，數(shù)量顯著增多（見圖4）；當(dāng)雌激素濃度為20 nmol/ L 時，BCSC 的2 個指標(biāo)均低于濃度為10 nmol/L時。

圖4 乳腺癌干細(xì)胞自我更新情況Fig.4 Self-renewal of BCSCs

2.4 BCSC 相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)

與0 nmol/L 比較，1，5，10 nmol/L 雌激素作用下，BCSC 的PI3K，AKT，mTOR mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），且在低濃度（1，5，10 nmol/ L）雌激素作用下存在濃度依賴性（見圖5）。

圖5 乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Fig.5 Expression of related gene mRNA in BCSCs

3 討論

近年來，手術(shù)切除和內(nèi)分泌靶向治療在乳腺癌治療中已取得顯著進(jìn)展，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是乳腺癌患者面臨的兩大死亡原因［7］。臨床醫(yī)師常長期補(bǔ)充雌激素治療婦科內(nèi)分泌疾病，但該治療方法存在很大爭議。有研究報道，補(bǔ)充雌激素會顯著增加罹患婦科腫瘤的概率，但同時也有研究者發(fā)現(xiàn)，這種療法可減少婦科腫瘤的發(fā)生［8］。通過病例比對發(fā)現(xiàn)，長期服用雌二醇（E2）的絕經(jīng)期婦女的卵巢癌發(fā)病率比未服用E2者提高了55%；分析1966年至2006年大部分相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素療法實可顯著增加卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險。絕經(jīng)期婦女補(bǔ)充雌激素者乳腺癌發(fā)病率相較未補(bǔ)充者可顯著升高［9-10］。

國外近年有研究報道，不同濃度雌激素對MCF-7細(xì)胞生長的影響不同，其中，高濃度（20 nmol/ L）雌激素對MCF - 7 細(xì)胞生長有一定抑制作用［11-12］，但高濃度的雌激素對MCF - 7 細(xì)胞的抑制作用可能并不依賴于雌激素受體，不同濃度的雌激素作用于MCF - 7 細(xì)胞，可能產(chǎn)生不同效果。另有報道表明，雌激素對胸腺癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展、對化療耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程也存在相同作用［13］。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L 雌激素作用24 h可明顯促進(jìn)BCSC的自我更新能力，但20 nmol/L雌激素反而抑制其自我更新。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路的異常激活與癌細(xì)胞的增殖、膀胱癌干細(xì)胞（BCSC）的存活和耐藥性密切相關(guān)。RTK，GPCRs，Ras 可激活PI3K，激活后的PI3K 可活化其下游因子AKT 和PDK1。此外，mTOR，p70S6K，4E-BP1 和糖原合成酶激酶3（GSK3）是AKT 的下游效應(yīng)因子，可被AKT 激活，以刺激癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、生長、增殖和遷移［14-15］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)雌激素誘導(dǎo)后，BCSC 的PI3K，AKT，mTOR mRNA 的表達(dá)水平均顯著升高，且存在濃度依賴性，這可能意味著較低濃度（10 nmol/ L）的雌激素能有效促進(jìn)PI3K/ AKT/ mTOR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，低濃度（10 nmol/L）雌激素可提高BCSC的增殖、自我更新能力，此作用可能涉及PI3K/ AKT/mTOR信號通路，但仍需進(jìn)一步研究。