葡萄糖酸鈣注射液中細菌內毒素的定量檢測

朱文娟，李錦妹，翁 嘉，陳文靜，林鳳屏，李紅靜，黃永德

（惠州市食品藥品檢驗所，廣東 惠州 516003）

葡萄糖酸鈣注射液臨床主要用于治療人畜鈣缺乏癥及過敏性疾病，也可用于鎂、氟離子引起的中樞抑制的中毒解救[1-2]。微量動態顯色法（microkinetic chromogenic method）是一種新型內毒素定量檢測方法，具有靈敏度高、檢測范圍寬和鱟試劑用量少等優點，近年來受到越來越多的關注[3]。該方法使用酶標儀，通過檢測鱟試劑與內毒素反應產生的凝固酶使特定底物釋放出的對硝基苯胺（呈色團）的數量，依據呈色團的吸光度和內毒素濃度間對應關系，計算樣品中的內毒素含量[4-5]。微量動態顯色法不需要凝固蛋白原形成凝膠，直接通過儀器讀取結果，實現精準定量；實驗操作、數據記錄實現了從手工到自動化，保障了實驗過程的完整性和結果數據的可溯源性；96孔反應板可同時檢測多個濃度樣品，省時省力；此外，微量動態顯色法靈敏度比凝膠法高，適用于內毒素限值低的樣品的檢測，能較好地消除實驗中的干擾[6]。

本研究采用微量動態顯色法對葡萄糖酸鈣注射液進行內毒素定量檢測，同時與傳統的凝膠法進行比較，建立該品的細菌內毒素定量檢測方法，實現在線實時記錄生產各環節樣品內毒素含量的動態變化，有助于及時發現和分析潛在的污染來源，實現無菌藥品安全生產的全過程控制，更好地保障臨床安全用藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Multiskan ET內毒素檢測儀（美國賽默飛）；BioProbe生物探針5.2系統（湛江安度斯）；MS3漩渦混勻器（美國IKA）；TAL-96G試管恒溫儀（湛江安度斯）。

1.2 試藥

葡萄糖酸鈣注射液6批（規格為10 ml:1 g×5支，其中焦作市民康藥業有限公司3批，批號：21060403，21060502，22061903；常州蘭陵制藥有限公司3批，批號：12104090，12104210，12104130）；細菌內毒素工作標準品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201987，規格：80 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批號：2201260，濃度范圍為0.02～2.0 EU/ml）；動態顯色法鱟試劑（批號：2202230，規格：0.35 ml，定量范圍：10～0.01 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；凝膠法鱟試劑（TAL，批號：2204190，規格：0.65 ml/支，靈敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；細菌內毒素檢查用水（BET水，批號：2002260，湛江安度斯生物有限公司）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素的限值

2020年版《中國藥典》第二部品種項下規定：每1 mg葡萄糖酸鈣中含內毒素的量應小于0.17 EU[7]。

2.2 微量鱟試劑動態顯色法標準曲線可靠性試驗及凝膠法鱟試劑靈敏度復核

按使用說明，取3支湛江安度斯細菌內毒素工作標準品，濃度分別為0.02，0.2，2.0 EU/ml，用BET水復溶，并在漩渦混勻器上充分混勻30 s，同時用BET水作為陰性對照管。吸取上述系列濃度細菌內毒素標準溶液各25 μl至96孔反應板中；取動態顯色法鱟試劑，加BET水0.35 ml，充分復溶后吸取25 μl，分別加入標準溶液進行反應，每個濃度平行3管。預設吸收度（A）值為0.1，反應時間T為3600 s，溫度37 ℃，檢測波長405 nm，以T的對數為橫坐標，濃度（C）的對數為縱坐標，得出標準曲線和相關系數（r）值?；貧w方程為lgT=2.8974-0.29133lgC，相關系數│r│=1.0000＞0.980，變異系數（CV）值均＜10 %，陰性對照反應時間>3600 s，標準曲線可靠性試驗各數據符合要求，結果見表1。

表1 標準曲線的可靠性試驗結果（n=3）

凝膠法鱟試劑按2020年版《中國藥典》第四部通則1143要求進行靈敏度復核[8]，靈敏度為λ，符合規定。

2.3 兩種檢測法最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據MVD=cL/λ，c為樣品溶液濃度（100 mg/ml），L為葡萄糖酸鈣注射液細菌內毒素限值（0.17 EU/mg）；微量動態顯色法中λ為0.02 EU/ml，凝膠法中λ為0.25 EU/ml，計算出MVD在動態顯色法中為850，在凝膠法中為68。

2.4 預干擾試驗

分別選取2個廠家各1批樣品，用BET水依次稀釋至25，50，100，200倍（濃度分別為4，2，1，0.5 mg/ml），作為供試品溶液。按使用說明，吸取不同稀釋倍數的供試品溶液各700 μl，加入濃度為0.2 EU/ml的CSE干粉中，渦漩混勻30 s使其充分復溶，作為供試品陽性對照溶液。取上述制備的各溶液和標準曲線可靠性試驗中的0.02，0.2，2.0 EU/ml系列濃度CSE溶液各25 μl，加入96孔反應板，每個濃度平行2份；取BET水作為陰性對照。最后每孔加入25 μl 動態顯色法鱟試劑，用內毒素檢測儀測定。不同的稀釋倍數，樣品回收率均在50 %～200 %范圍內，見表2。在稀釋25倍時，不同樣品的回收率分別為64.46 %和56.13 %，由于56.13 %較低且接近最低限值，故選擇50倍稀釋的樣品進行正式干擾試驗。

表2 預干擾試驗結果（n=2）

2.5 正式干擾試驗

為確證葡萄糖酸鈣注射液50倍稀釋的有效性，進行2個不同廠家各3個批號樣品的正式干擾試驗。樣品稀釋50倍后，按預干擾試驗的方法進行測定，計算樣品內毒素加標回收率和本底內毒素含量。實驗的回收率范圍在63.49 %～69.55 %，符合藥典要求，結果見表3。結果顯示，樣品在50倍稀釋下不存在抑制或增強的干擾作用；各試驗組平行管的CV值均＜1.5 %；供試品的平均反應時間均＞3600 s，實測值均＜0.00391 EU/ml。標準曲線的最小濃度為0.02 EU/ml，稀釋倍數為50，因此6批葡萄糖酸鈣注射原液內毒素結果均＜1.000 EU/ml，結果最后換算為＜0.01 EU/mg，符合藥典規定的＜0.17 EU/mg。在本試驗條件下，葡萄糖酸鈣注射液的最大無干擾稀釋倍數為50倍。如果采用的鱟試劑靈敏度不同，需按本試驗方法重新確認稀釋倍數。

表3 正式干擾試驗結果（n=2）

2.6 凝膠法檢測

用BET水將樣品依次稀釋至34，68倍，作為2倍供試品溶液和供試品溶液。用BET水將CSE標準品（80 EU/ml）稀釋至1.0，0.5 EU/ml，作為4λ，2λ陽性對照溶液。取等量2倍供試品溶液和4λ陽性對照溶液充分混勻，作為供試品陽性對照溶液（2λ）。吸取0.05 ml鱟試劑溶液至各小試管，分別加入0.05 ml供試品溶液、供試品陽性對照溶液（2λ）、陽性對照溶液（2λ）、陰性對照溶液，每種平行兩管，輕搖混勻，放入試管恒溫儀中，37 ℃孵育60 min后取出，觀察凝膠成像結果。結果均符合規定，詳見表4。

表4 凝膠法檢測結果

3 討論

葡萄糖酸鈣注射液細菌內毒素檢測結果，微量動態顯色法與凝膠法一致，均符合《中國藥典》2020年版品種項下規定[7]。相較凝膠法，微量動態顯色法有以下優勢：一是鱟試劑的使用量僅為凝膠法的1/4，可大大減少對國家二級保護動物鱟資源的需求；二是微量動態顯色法的檢測限寬，有利于一次性對各種潛在干擾濃度進行篩選，大幅減少鱟試劑的用量，實現大范圍快速篩查；三是可實現實時定量檢測，靈敏度高[9]，檢測結果可以精確的數值表示，生產質控人員可了解產品中內毒素含量的變化趨勢，有利于注射液生產全過程中的關鍵風險控制點的安全監控[10-13]；四是檢測過程和數據處理皆由儀器自動化控制，可實時觀察和監控動態反應，避免主觀判斷影響結果，實現數據的可溯源。除此之外，基于顯色基質顏色的變化速率來定量檢測內毒素的微量動態顯色法，不受凝膠形成和濁度測定的的干擾因素影響[14-15]，同時具備動態濁度法和終點法的優點。

葡萄糖酸鈣注射液的臨床用途和適用人群廣泛，內毒素限值較低，更應嚴控質量，降低風險。本實驗建立的微量動態顯色法，實現了過程的可控和結果的精確定量，操作簡便，可用于大批量檢測，能更好地保障臨床用藥和藥品的安全生產。