DART-MS/MS快速檢測食品中非法添加的N-芐基他達拉非等7種新型PDE-5型抑制劑

任 靜，董培智，趙麗紅

（1. 山西中醫藥大學，山西 晉中 030619；2. 山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術研究所 食品藥品安全防控山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

近年，很多不法商家在利益的驅動下，在一些食品中非法添加化學物質以增強其宣稱功能。由于添加的化學物質未經毒理學實驗評價且劑量隨意，對消費者的身心健康帶來一定隱患[1]。因此，解決食品安全中存在的非法添加亂象及建立相應的檢測方法顯得尤為重要。

目前，文獻報道中有關磷酸二酯酶5（PDE-5）抑制劑傳統檢測方法多為高效液相色譜法[2-4]，液相色譜串聯質譜法[5-9]，核磁共振波譜法[10-12]等。上述方法中，所使用的儀器設備較大，大多需要繁瑣的樣品提取、制備和分離過程[13]，且成本高，污染大。理想的快速檢測方法應該是具有快速、省時、簡便、環保等特點[14]。

近年興起的實時直接分析（direct analysis in real time，DART）質譜是一種新型的質譜電離技術[15-16]。其原理是利用He或N2氣體分子在高壓放電針下形成輝光放電產生等離子體，隨后等離子體打在待測品表面，使待測物品分子電離，產生的離子進入質譜檢測器進行檢測[17-19]。DART質譜不再需要繁瑣的樣品前處理、制備大量的流動相，只需幾秒鐘就可分析單個樣品，特別適合樣品的實時、快速、高通量篩查[20]。

本研究以市售宣稱具有抗疲勞等作用的食品為研究對象，采用DART-MS/MS技術對非法添加的PDE-5抑制劑的分析條件進行優化，建立了一種高效、準確、快速、簡單的分析方法，以期為保障食品質量安全提供技術支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Ultivo LC/TQ質譜儀（美國安捷倫公司）；SVP-DART離子源（美國IonSense公司）；Eppendorf移液器（德國艾本德公司）；DV215CD電子天平（美國奧豪斯公司）。

1.2 藥品與試劑

3-羥丙基去甲他達拉非對照品，羥基卡巴地那非對照品，環己基去甲他達拉非對照品，四氫咔啉對照品，N-苯基丙氧苯基卡巴地那非對照品，N-芐基他達拉非對照品（加拿大TLC Pharmachem公司）；丙氧苯基去碳去甲基卡巴地那非對照品（湖北省藥品監督檢驗研究院）。以上對照品純度均≥96.0 %。乙腈（色譜純，美國迪馬公司）；高純氦氣，氮氣（純度≥99.999 %，太原市泰能氣體有限公司）。牡蠣粉，蛋白粉，咖啡，金咖啡，蟲草強腎片樣品為歷年抽檢樣品；海參肽片、鹿鞭牡蠣粉由上海市食品藥品檢驗研究院提供。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

分別準確稱取7種那非類對照品各5 mg，置入50 ml量瓶，用乙腈溶解并定容，得到100 μg/ml的儲備溶液，保存在0～5 ℃冰箱中，臨用前用乙腈稀釋為10 μg/ml的工作液或配制成10 μg/ml的混合溶液。

2.2 樣品前處理

取樣品適量，混勻，研細，取約2 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，用乙腈定容[21]，然后手動振搖混合溶液10 s。用移液器吸取4 μl溶液置玻棒尖端，滑動速度為0.2 mm/s，然后在氦氣流中放置約10 s，進樣。

2.3 檢測條件

DART條件：氦氣為離子化氣體，氮氣為待機氣體，采用12位液體樣品進樣模塊（12-Dip-it Module）進樣，篩網電壓為250 V，離子源出口距質譜進口為2.5 cm，氣體壓力為0.50 MPa，用濃度為10μg/ml的單一對照品溶液和10 μg/ml的混合對照品溶液分別優化7種PDE-5抑制劑的離子源溫度、進樣速率和進樣體積，以碎裂離子的總峰面積選擇最優參數，其余DART參數均為儀器默認設置。

MS/MS條件：正離子模式采集；碎裂電壓135 V；質量掃描范圍為m/z100～1000；采用多反應監測（MRM）模式，將濃度為10 μg/ml的7種PDE-5標準溶液進行二級質譜碎裂，以碎裂離子峰的峰面積選定最優碰撞能量（見表1），其余質譜參數為儀器默認參數。

表1 7種PDE-5抑制劑的質譜檢測參數

2.4 定性過程

用移液器吸取4 μl混合對照品溶液（10 μg/ml）點于自動進樣架上的玻棒尖端，DART離子源和MS/MS條件見2.3，在MRM模式下進行二級質譜碎裂，確定了7種PDE-5化合物的碎片離子峰（見表1），并利用離子豐度比進行定性分析，當樣品色譜圖中所選擇監測離子對的相對豐度比與相當濃度的對照品溶液的離子相對豐度比（K）偏差不超過規定范圍[21]，即可判定樣品中檢出相應的化合物。

3 結果與分析

3.1 DART離子源條件的優化

3.1.1 離子源溫度的選擇 對于DART離子源，其溫度的改變會影響化合物的離子化效率。DART加熱室的溫度提高，激發態氦原子的離子化能力也隨之增強，使得分子離子碎片的比例提高[22]。因此，實驗中用單一對照品溶液對DART離子源溫度進行優化。分別取適量10 μg/ml單一對照品溶液，分別于300～500 ℃（以50 ℃為梯度）下進樣，利用每個溫度下測得的離子總峰面積來評價離子源溫度對檢測靈敏度的影響，結果見圖1。由圖1可見，溫度在300～500 ℃范圍內，離子化效率隨溫度的升高呈上升趨勢。300 ℃時7種化合物的總峰面積很小，這可能是由于較低溫度下分析物的解吸不良導致[23]。超過450 ℃后離子信號減弱，這可能是由于溫度過高使得樣品分解、碳化[24]。綜合考慮最終選擇的最佳溫度為450 ℃。

圖1 7種PDE-5抑制劑離子總峰面積與離子源溫度的關系

3.1.2 樣品傳輸速度的選擇 對于DART離子源，其軟件操控的滑動軌道速度也會對結果造成影響。一般來說樣品傳輸速度越小，離子化氣體與目標化合物接觸越充分，進入檢測器的離子越多，離子響應強度也越高，反之，離子化強度越低[25]。因此，本試驗用混標溶液對樣品傳輸速度進行優化。分別取適量10μg/ml混合對照品溶液，分別在0.2～1.0 mm/s（以0.2 mm/s為梯度）速度下進樣，利用每個速度下測得的離子總峰面積來評價樣品傳輸速度對離子化效率的影響，結果見圖2。由圖2可見，樣品在0.2 mm/s的傳輸速度下得到的離子峰面積最大，且峰形良好。綜合其對各檢測值的影響，最終選擇的最佳傳輸速度為0.2 mm/s。

圖2 7種PDE-5抑制劑離子總峰面積與進樣速率的關系

3.1.3 進樣體積的選擇 實驗中發現利用玻管蘸取混合對照品溶液置氦氣流中，其質譜信號弱，且峰形較差。故采用移液器吸取混合對照品溶液置玻管尖端的方式，對進樣體積進行優化。分別吸取2～10 μl（以2 μl為梯度）濃度為10μg/ml的混合對照品溶液進樣，利用每個待測體積下測得的離子總峰面積來評價進樣體積對檢測靈敏度的影響，結果見圖3。由圖3可見，離子信號強度隨進樣體積的增加而增加，但隨著進入質譜儀的離子增多，而質譜儀中可容的離子數量有限，離子的響應強度也會隨之減弱[26]。綜合考慮，選擇4μl作為最優進樣量。

圖3 7種PDE-5抑制劑離子總峰面積與進樣體積的關系

3.2 專屬性

分別取空白溶劑、對照品溶液，并將收集好的陰性、陽性、基質樣品按2.2項下方法操作，獲得相應色譜圖，見圖4。結果表明，7種被測成分的響應均未受到溶劑、樣品組分的干擾，且響應度良好。

圖4 DART-MS/MS檢測食品中7種新型PDE-5型抑制劑的典型圖譜

3.3 重復性

取陰性蛋白粉樣品適量，加入一定體積的對照品溶液，混勻，晾干，自制同一含量的陽性樣品粉末6份并進行測定。3-羥丙基去甲他達拉非、羥基卡巴地那非、環己基去甲他達拉非、四氫咔啉、N-芐基他達拉非、N-苯基丙氧苯基卡巴地那非、丙氧苯基去碳去甲基卡巴地那非的平均含量分別為1.36，0.7，12，0.6，6.2，0.6，3.2 μg/g；RSD分別為8.7 %，10.1 %，2.4 %，3.4 %，2.8 %，5.2 %，10.8 %。

3.4 穩定性

分別考察3.3項下自制陽性樣品溶液于25 ℃放置0，2，4，8，12，24 h的穩定性，并進樣分析。結果表明，自制陽性樣品在室溫考察時間內均穩定，RSD為1.6 %～6.0 %。

3.5 檢出限

在上述優化后條件下，在空白基質中加入混標溶液，樣品經前處理后進樣檢測。以3倍信噪比時進樣濃度為檢出限確定了7種PDE-5抑制劑的檢出限，見表2。由表2可見，該方法PDE-5抑制劑的檢出限為0.025～12.5 μg/g，可滿足此類藥物的篩查要求。

表2 7種PDE-5抑制劑檢出限

表3 180批市場抽檢樣品檢出情況

3.6 樣品檢測

采用本方法對180批次市場抽檢樣品進行檢測。比較樣品與對照品的分子離子峰及碎片離子峰的相對離子豐度：樣品色譜圖中所選擇監測的離子相對豐度與相當濃度對照品溶液的離子相對豐度比（K）偏差不超過規定范圍[±（20 %～25 %）][21]，檢測結果發現4種陽性樣品，分別非法添加羥基卡巴地那非、環己基去甲他達拉非、N-芐基他達拉非和N-苯基丙氧苯基卡巴地那非。

4 結論

本試驗建立了采用DART離子源結合三重四極桿質譜定性檢測3種基質中7種PDE-5抑制劑的方法。該方法與傳統的液相、液質等技術相比，不需要復雜的樣品前處理、耗時的色譜分離及大量化學試劑的消耗，適用于食品中非法添加的PDE-5抑制劑的快速篩查。