響應面法優化雙柏散中總黃酮的超聲波萃取工藝

劉建清，林水森，謝志新，謝娜娜

（泉州醫學高等專科學校 藥學院，福建 泉州 362000）

雙柏散是已故名老中醫黃耀燊的經驗方，處方由大黃、側柏葉、黃柏、澤蘭、薄荷組成，臨床用于跌打損傷、紅腫疼痛等癥狀治療，因療效可靠、安全性高被收錄于《中醫傷科學講義》中[1-2]。

為提高雙柏散使用方便性，近年，雙柏散被研制成軟膏劑、噴霧劑、巴布劑等新劑型，其中雙柏散的提取是新劑型研發成功的關鍵，也是后續臨床應用安全、有效的保障。目前關于雙柏散提取，尤其是提取優化的文章報道較少。超聲波萃取是利用超聲波具有機械效應、空氣效應和熱效應等特點，提高萃取溶劑的擴散和滲透能力，從而促進目標成分提取的方法，具有無需高溫、常壓萃取、萃取率高等優點[3-6]。

本研究以總黃酮為指標，采用響應面法對雙柏散超聲波萃取工藝進行優化，探究雙柏散最佳提取工藝，為后期雙柏散新劑型的研究提供技術參數。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA623S精密電子天平[Satorius（北京）]；CN-LQC3001電子天平（昆山優科維特）；UV-2700型紫外分光光度計（島津-蘇州）； Scientz-250/500/1000c多功能恒溫超聲波萃取儀（新芝科技）；80-2電動離心機（常州國宇）。

1.2 試藥

大黃（產地甘肅，批號：220102），側柏葉（產地江蘇，批號：220302），黃柏（產地四川，批號210602），澤蘭（產地福建，批號220202），薄荷（產地江蘇，批號220102），均購自銘遠健康集團有限公司。蘆丁對照品（源葉生物，批號：153-18-4），乙醇（西隴科學，批號：2109011）。

2 方法與結果

2.1 蘆丁對照品儲備液配制

精確稱量蘆丁對照品0.0323 g，置50 ml量瓶中，加70 %乙醇溶解定容，搖勻，即得0.646 mg/ml的對照品儲備液。

2.2 線性與回歸方程

精密量取對照品儲備液（0.646 mg/ml）0.5，1，1.5，2，2.5 ml，分別置50 ml量瓶中，加70 %乙醇定容。采用直接測定法，于254 nm處分別測定各對照品溶液吸光度（A）。以蘆丁濃度（mg/ml）為橫坐標、A值為縱坐標繪制標準曲線，可得回歸方程：Y=31.194X+0.00683，r=0.9997，表明蘆丁對照品濃度在0.00646～0.0323 mg/ml范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3 雙柏散總黃酮提取及測定

按處方比例稱取大黃、側柏葉等混合，粉碎成粗粉后，按液料比20加入70 %乙醇，于40 ℃下超聲20 min，經紗布過濾取藥液于3000 r/min離心5 min，取上清0.5 ml加70 %乙醇定容至50 ml。按2.2項下方法進行測定。

2.4 單因素考察

影響超聲波萃取工藝的因素較多，本試驗通過前期考察及參考相關文獻[7]，最終確定乙醇濃度、液料比、超聲溫度及超聲提取功率4個因素進行超聲波萃取單因素考察，具體考察條件見表1。

表1 單因素考察條件設計

2.4.1 不同濃度乙醇對總黃酮超聲提取率的影響 結果見圖1。

由圖1可見，當乙醇濃度逐漸升高時，雙柏散中總黃酮的提取率呈先增后減趨勢。這可能是因為乙醇在低濃度時，隨著濃度升高，對總黃酮類化合物的溶解度隨之增加，但乙醇達到一定濃度后，乙醇溶液極性大小及溶解范圍出現變化，總黃酮類化合物的溶出量下降；同時雙柏散中的糅質、色素等雜質溶出增多，也干擾總黃酮的測定，進而影響雙柏散的提取率。

2.4.2 液料比對雙柏散中總黃酮提取率的影響 結果見圖2。

由圖2可知，在液料比10～25范圍內，總黃酮提取率隨著提取溶劑量的增加而提高。在液料比20～30范圍內，總黃酮提取率升高趨勢已不明顯，當液料比為30時，總黃酮提取率甚至出現了下降趨勢，這說明總黃酮的溶出擴散已達到平衡，增加溶劑量對總黃酮提取效果意義不大。

2.4.3 超聲萃取溫度對雙柏散中總黃酮提取率的影響 結果見圖3。

圖3 超聲萃取溫度對雙柏散中總黃酮提取率的影響

由圖3可見，30～60 ℃范圍內，隨著超聲溫度的升高，總黃酮提取率隨之升高。但隨著溫度進一步升高，超過60 ℃后，總黃酮提取率反而下降，這可能是因為當溫度升高到一定程度后，雙柏散中總黃酮類化合物被破壞，反而使提取率下降。

2.4.4 超聲功率對雙柏散中總黃酮提取率的影響 結果見圖4。

圖4 超聲功率對雙柏散中總黃酮提取率的影響

由圖4可見，當超聲功率較低時，如超聲功率為540 W時，總黃酮的提取率為7.23 %，隨著超聲功率的提高，當超聲功率為720，900，1080，1260 W時，總黃酮的提取率為8.3 %～8.7 %。這說明當超聲功率達到720 W后，隨著超聲功率的提高，對于總黃酮的提取影響較小，最后將提取超聲功率定為900 W。

2.5 響應面法優化超聲波萃取工藝

2.5.1 試驗設計及結果 根據單因素水平考察結果，選取對總黃酮提取率影響較大的因素，包括乙醇濃度、液料比、溫度3個因素，以總黃酮提取率為指標，采用三因素三水平的試驗設計，優化雙柏散的超聲萃取工藝，各因素水平見表2，響應面法結果見表3。

表2 三因素三水平響應曲面法試驗設計表

表3 試驗優化雙柏散中總黃酮超聲萃取試驗設計及結果

2.5.2 線性擬合結果 用Design Expert 8.05軟件對表3數據進行非線性方程擬合[8-9]，以提取率（Y）為因變量，各提取因素為自變量，可得Y=8.57-0.71A+0.27B+0.17C+0.02AB-0.35AC-0.07BC-1.22A2-0.082B2-0.21C2，該模型相對應P值<0.0001，可知該模型顯著，預測好（失擬項P=0.7510＞0.05），變異系數（CV）=0.96 %，可知工藝穩定性好，可靠性高，具有一定的實踐指導意義，見表4。

表4 方差分析結果

2.5.3 響應面優化結果 根據回歸方程，做不同提取條件的響應面圖，結果見圖5。從圖中可看出不同提取條件相互作用對總黃酮提取率的影響，其中乙醇濃度和溫度的相互作用影響較為顯著。

圖5 不同因素相互作用對雙柏散中總黃酮提取效果影響的響應面圖

2.5.4 驗證試驗 以Design-Expert 8.05軟件優化得總黃酮的超聲萃取工藝為：乙醇濃度62.26 %，液料比24.77，超聲溫度54.29 ℃。為方便試驗可操作性，進一步將超聲萃取工藝確定為乙醇濃度62 %，液料比25，超聲溫度54 ℃，按該工藝進行3批雙柏散超聲萃取驗證，結果顯示提取率為8.80 %±0.13 %（RSD=1.45 %，n=3），與預測值的相對誤差為2.13 %，提示模型預測較好。

3 討論

現代研究表明黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、鎮痛等作用，起到消腫止痛之功[10-12]。雙柏散中的大黃、側柏葉及澤蘭均含有黃酮類化合物，因此本試驗選擇總黃酮為指標優化雙柏散的超聲萃取工藝。

超聲波萃取工藝研究中，為保證試驗準確性和平行性，在操作中應注意一些細節，減少組間人為差異，包括超聲結束后應迅速過濾，防止雙柏散繼續在乙醇中浸潤；超聲過程中需用保鮮膜遮蓋，防止乙醇在超聲過程中揮發，影響總黃酮的測定。

本文在單因素考察基礎上，通過響應面法優化雙柏散中總黃酮的超聲萃取工藝，最終確定超聲波萃取條件為乙醇濃度62 %，液料比25，超聲溫度54 ℃，該工藝獲得的總黃酮提取率平均約8.8 %，與軟件預測結果接近，表明建立的響應面法模型可靠。