塞來昔布自微乳的制備及體外溶出研究

楊雪華，毛楷凡，劉正平,，李大偉,*，張岱州,*

（1. 山東省藥學科學院 新型緩控釋制劑與藥物靶向遞送系統山東省工程研究中心，山東 濟南250101；2. 國家藥監局藥物制劑技術研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101； 3. 山東福瑞達醫藥集團有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101）

塞來昔布（celecoxib，CXB）是新一代非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID），可通過選擇性抑制環氧化酶2來抑制前列腺素的生成，繼而發揮抗炎鎮痛作用[1]。與其他NSAID相比，CXB同樣用于治療骨關節炎、類風濕性關節炎和急性疼痛，但不同的是，CXB治療效果更好，且上消化道潰瘍及其他并發癥的發生率最低[2]。然而根據生物制藥分類系統，CXB屬于II類藥物（高滲透性和低溶解性），其有限的水溶性極大地影響了其口服生物利用度。因此，亟需通過各種增溶技術來增加CXB的水溶性。近年，研究人員將CXB制備成固體分散體、納米混懸液及脂質體等來改善其水溶性，但這些手段增溶有限，且都存在制備工藝復雜、難以放大生產的缺點[3]。

自微乳藥物遞送系統（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）是由油相、乳化劑、助乳化劑混合而成的液態或類固態制劑[4]。SMEDDS口服后能在胃腸道的蠕動下與胃液、腸液融合，自發分散形成粒徑小于100 nm的O/W型乳液，可極大地提高藥物的溶解度和口服生物利用度[5]。且SMEDDS具有生物相容性好、穩定性高及容易放大生產的優點[6]。因此，本研究擬將CXB制備成SMEDDS，以期實現增加CXB溶解度、改善胃腸道吸收、提高口服生物利用度的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 8454型紫外分光光度計（美國安捷倫公司）；LOGAN 860DL型智能溶出儀（美國LOGAN公司）；MS204TS/02型電子天平（美國梅特勒-托利多儀器有限公司）；C-MAG HS4型磁力攪拌器（德國IKA公司）；Nano-ZS90型馬爾文激光粒度分布與電勢分析儀（英國Malvern公司）；Talos F200s型透射電子顯微鏡（FEI公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲設備有限公司）。

1.2 材料

塞來昔布原料藥（自制，批號：210304）；中鏈甘油三酯（MCT，批號：177185，法國嘉法獅公司）；聚氧乙烯35蓖麻油（ELP35，批號：7778402UO，北京鳳禮精求醫藥有限公司）；丙三醇（批號：B2108262，西隴科學股份有限公司）；甲醇（批號：20211118），無水乙酸鈉（批號：20180307），磷酸二氫鈉（批號：20161011），十二烷基硫酸鈉（SDS，批號：20170904），鹽酸（批號：20190320，國藥集團化學試劑有限公司）；醋酸（批號：20170712，天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號：20210504，天津市大茂化學試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 CXB-SMEDDS的制備

分別以中鏈甘油三酯（MCT）、聚氧乙烯35蓖麻油（ELP35）、丙三醇作為油相、乳化劑及助乳化劑。參考相關文獻[7]確定了CXB-SMEDDS的制備工藝，即先稱取一定量的MCT、ELP35及丙三醇，磁力攪拌10 min后得到空白SMEDDS,稱取一定量的CXB加入空白SMEDDS中，磁力攪拌10 min，得到CXB-SMEDDS。

2.2 處方篩選

先通過偽三元相圖的繪制確定能發生乳化的處方比例范圍，再通過單純形網格法進行處方優化。

2.2.1 偽三元相圖的繪制 按乳化劑與助乳化劑的質量比為1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，分別稱取相應量的ELP35與丙三醇，再將此混合乳化劑與油相MCT按9:1～5:5的質量比分別混勻，然后將CXB按25 mg/g的載藥量加入上述空白SMEDDS中，混勻，即得系列CXB-SMEDDS。將0.5 g CXB-SMEDDS在磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入50 ml 37 ℃蒸餾水中，觀察各CXB-SMEDDS能否發生自乳化。乳化的標準分為5個等級：A：乳化時間＜1 min，溶液呈澄清或略泛藍光；B：乳化時間＜1 min，略濁，呈藍白色；C：乳化時間1～2 min，呈亮白色不透明液體；D：乳化時間＞2 min，色澤暗，呈灰白色，略帶油狀；E：難乳化，一直有油滴存在[8]。記錄形成A、B等級微乳時MCT、ELP35及丙三醇各自的質量分數，并以各組分為三元相圖頂點，利用origin軟件繪制三元相圖。圖1為根據實驗結果繪制的偽三元相圖，由圖1可知，能發生乳化的各組分比例范圍為，MCT 10 %～40 %，ELP35 9 %～81 %，丙三醇6 %～81 %。

圖1 CXB-SMEDDS的偽三元相圖

2.2.2 單純形網格法優化處方 固定處方中MCT、ELP35、丙三醇的總比例為100 %，以2.2.1項下各組分比例范圍為基礎，結合單純形網格法比例約束及各組分一般用量，確定M C T 比例范圍為10 %～40 %，ELP35為30 %～60 %，丙三醇為30 %～60 %。以CXB-SMEDDS的平均粒徑（Y1）、多分散指數（PDI，Y2）、乳化時間（Y3）為評價指標，采用Design Expert軟件中Simplex Lattice對處方進行設計，見表1。按表1稱取各組分，磁力攪拌10 min，得空白SMEDDS，按25 mg/g的比例稱取CXB，加入空白SMEDDS中，磁力攪拌10 min，得CXB-SMEDDS。稱取1 g CXB-SMEDDS，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入到100 ml 37 ℃蒸餾水中。記錄乳化時間，并取部分乳液用馬爾文激光粒度分布儀測定其粒徑和PDI。

表1 單純形網格法優化實驗設計及結果

單純形網格法優化處方實驗結果見表1。采用Design Expert軟件，以Y1、Y2、Y3為評價指標，通過模型擬合得響應方程分別為：Y1=182.01A+18.16B+25.87C-265.30AB-232.02AC-2.08BC-2238.07A2BC+1381.37AB2C+1281.95ABC（P＜0.0001，R2=0.9994）；Y2=0.2405A+0.0707B+0.0964C-0.3584AB-0.2005AC+0.0209BC（P＜0.0001，R2=0.9660）；Y3=70.85A+8.79B+9.15C+65.78AB-63.83AC-0.5055BC-347.69A2BC+253.15AB2C+65.98ABC2（P＜0.0001，R2=0.9999）。對上述回歸模型進行方差分析，結果表明，模型的P值均小于0.0001，遠小于 0.05，表明模型顯著可靠；模型的回歸方程系數R2及校正決定系數（adjustR2）均大于 0.95，表明模型相關系數較高，非線性擬合的效果良好。

根據上述回歸模型，繪制三維效應面圖，見圖2。由圖2可見，MCT用量對3個評價指標的影響最大，隨著MCT比例的增大，粒徑、PDI和乳化時間都逐漸增大，可能是因為隨著油相比例增大，乳化過程變得困難，導致乳化時間延長，形成的乳液粒徑較大，粒徑均一性也較差。ELP35用量對3個評價指標的影響弱于MCT，但也有一定影響，粒徑、PDI和乳化時間都隨著ELP35比例的增大而減小，表明隨著乳化劑用量的增加，CXBSMEDDS在水中更易自發形成粒徑較小的乳液。而助乳化劑丙三醇對3個評價指標的影響比較小，其主要起增溶藥物、促進微乳形成并增加微乳穩定性的作用。

圖2 各組分比例對CXB-SMEDDS的粒徑（A）、PDI（B）及乳化時間（C）影響的三維效應面圖

2.2.3 最優處方確定與驗證 CXB-SMEDDS的粒徑越小，比表面積越大，藥物溶出與吸收就越快；自乳化時間越短，乳化效果越好；PDI值小于0.2時，乳液的分散性較好。綜合3個指標，通過軟件預測得最優處方為MCT 10 %、ELP35 59.45 %、丙三醇30.55 %。為便于實驗操作，將處方調整為MCT 10 %、ELP35 60 %、丙三醇30 %。根據預測的最優處方制備 3 批CXB-SMEDDS，測定其粒徑、PDI與乳化時間，計算預測值與實測值之間的偏差，結果見表2。結果表明，各評價指標的預測值與實測值之間的偏差較小，說明所建立的數學模型具有良好的預測效果。

表2 最優處方驗證實驗結果（ ±s，n=3）

表2 最優處方驗證實驗結果（ ±s，n=3）

評價指標預測值實測值偏差/%粒徑/nm15.5316.21±0.724.38 PDI0.0660.072±0.0112.26乳化時間/s8.748.42±0.633.66

2.3 CXB-SMEDDS的質量評價

2.3.1 外觀性狀 將新鮮制備的CXB-SMEDDS置于西林瓶中，肉眼觀察其外觀性狀，見圖3。稱取CXB-SMEDDS 1 g，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入到100 ml 37 ℃蒸餾水中，觀察乳液的外觀性狀。由圖3A可見，CXB-SMEDDS在室溫（25 ℃）下呈無色透明溶液，流動性較好。由圖3B可見，CXB自乳化后能形成略泛藍光的溶液。

圖3 CXB-SMEDDS自乳化前（A）和自乳化后（B）的外觀性狀

2.3.2 微觀形態 采用透射電子顯微鏡觀察CXBSMEDDS的微觀形態。稱取CXB-SMEDDS 1 g，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入37 ℃蒸餾水100 ml中，得到CXB乳液。將該乳液滴在覆有支持膜的銅網上，靜置10 min，再滴加1 %磷鎢酸溶液于銅網上，負染2 min后用濾紙片吸干，過夜干燥，透射電鏡下觀察，結果見圖4。結果表明，CXBSMEDDS 自乳化后形成的乳滴呈均一的圓球形，粒徑為20 nm左右。

圖4 CXB-SMEDDS的透射電鏡圖

2.3.3 粒徑與電位分布 稱取CXB-SMEDDS 1 g，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入到100 ml 37 ℃蒸餾水中，得到CXB乳液。用Malvern激光粒度分布與電勢分析儀測定該乳液平均粒徑及Zeta電位分布，結果見圖5。結果表明，CXB-SMEDDS自乳化后形成的乳滴的平均粒徑為（16.21±0.72）nm，粒徑較小。PDI為0.072±0.011，表明粒度分布比較均勻。電位為（-15.8±1.2）mV。

圖5 CXB-SMEDDS和CXB原料藥在水（A）、pH 1.2鹽酸溶液（B）、pH 4.5醋酸鹽溶液（C）和pH 6.8磷酸鹽溶液（D）中的溶出曲線

2.3.4 載藥量與包封率

2.3.4.1 CXB的含量測定 采用紫外分光光度法測定CXB的含量。精密稱取CXB原料藥細粉30.00 mg，置于100 ml量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度，配成300 μg/ml的儲備液。精密移取200 μl儲備液至10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，得6 μg/ml的溶液，紫外掃描確定CXB的最大吸收波長。精密移取儲備液50，100，200，300，400，500 μl至10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，于最大波長條件下測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，質量濃度C（μg/ml）為橫坐標繪制標準曲線。按上述步驟配制低、中、高3種不同濃度的溶液，測定吸光度，計算回收率和精密度。結果顯示，CXB在甲醇中的標準曲線為y=0.0563x-0.0143，R2=0.9998,表明CXB在1.5～15 μg/ml范圍內線性關系良好。回收率和精密度試驗的結果也表明，本含量測定方法的回收率與精密度良好。

2.3.4.2 載藥量與包封率的測定 精密稱取1.0000 g CXB-SMEDDS（其中含CXB的量為W0），置于100 ml量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度，配成儲備液。精密移取500 μl儲備液至10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，于最大波長條件下測定其吸光度，按2.2.4.1 項下方法計算其藥物含量（W1）。精密稱取1.0000 g CXB-SMEDDS，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入100 ml 37 ℃蒸餾水中，得CXB乳液。取該乳液2 ml，置于離心管中，10 000 r/min離心 15 min，精密移取上清500 μl至10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于最大波長條件下測定其吸光度，按2.2.4.1 項下方法計算其藥物含量（W2）。根據公式：載藥量=W1/W0，包封率=W2/W1，計算相應的載藥量與包封率。最終測得CXB-SMEDDS的載藥量為標示量的101.42 %±0.29 %，包封率為98.05 %±0.18 %，均符合要求。

2.4 CXB-SMEDDS的體外溶出評價

2.4.1 CXB溶出度測定方法的建立 建立CXB在4種不同溶出介質（水、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽溶液、pH 6.8磷酸鹽溶液）中的含量測定方法。精密稱取CXB原料藥細粉 15.00 mg，置于100 ml量瓶中，加適量溶出介質（含SDS）超聲溶解，并稀釋至刻度，配成150 μg/ml儲備液。精密移取400 μl儲備液至10 ml量瓶，用溶出介質稀釋至刻度，得6 μg/ml的溶液，紫外掃描確定CXB的最大吸收波長。精密移取儲備液100，200，400，600，800，1000 μl至 10 ml量瓶，用溶出介質稀釋至刻度，于最大波長條件下測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，質量濃度C（μg/ml）為橫坐標繪制標準曲線。按上述步驟配制低、中、高3種不同濃度的溶液，測定吸光度，計算回收率和精密度。結果見表3。由表3可知，本方法回收率與精密度良好，CXB在各溶出介質中線性關系良好。

表3 CXB在各溶出介質中的標準曲線、精密度與回收率測定結果

2.4.2 CXB-SMEDDS體外溶出度的測定 按《中國藥典》2020年版溶出度測定法第二法（槳法）進行CXB-SMEDDS的溶出度測定。溶出度測定要求為：溶出介質為水、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽溶液及pH 6.8磷酸鹽溶液，溶出介質的體積為500 ml，轉速為 50 r/min，溫度為（37±0.5）℃。精密稱取原料藥12.50 mg和CXB-SMEDDS 0.5000 g，分別投入溶出杯中，分別于 5，10，15，30，45，60，90，120 min取樣7 ml，并及時補入同溫度介質7 ml，所取樣品用0. 45 μm微孔濾膜濾過。按2.4.1項下方法，測定溶出量，繪制溶出曲線。

CXB-SMEDDS和CXB原料藥在各介質中的溶出曲線見圖5。由圖5可見，CXB原料藥在各介質中的溶出都比較少，24 h內累積溶出度均小于10 %，表明原料藥較差的水溶性限制了其溶出。而CXB-SMEDDS在4種溶出介質的溶出均較快，5 min內平均溶出度大于43.94 %，45 min的累積溶出度達到了87.48 %以上，此后一直維持在這個水平，溶出較完全。CXB-SMEDDS在各個介質中溶出行為沒有差異，可以預測CXB-SMEDDS口服后在胃以及小腸、十二指腸等部位的溶出行為也相似，都能實現較快較完全的溶出。綜上，與CXB原料藥相比，CXB-SMEDDS的溶出度大大提高，由此推測，將CXB制成CXB-SMEDDS后可改善CXB的胃腸道吸收，大大提高CXB的口服生物利用度。

3 討論

SMEDDS體系通常由油相、乳化劑及助乳化劑組成，油相對SMEDDS的形成十分重要。本研究選擇MCT作為油相，是因為MCT是脂溶性藥物強大的增溶劑，CXB在MCT中的溶解度可達到載藥量的要求，同時MCT脂肪鏈較短，易微乳化，消化吸收快。且MCT還具有很多其他優良性質，如安全性高、預防肥胖、抗疲勞及提高免疫力等[9]。

篩選最佳處方是制備SMEDDS的中心環節。SMEDDS一般先通過偽三元相圖的繪制，確定能發生自乳化的各因素的比例范圍，再通過單純網格優化確定各因素的最佳比例。當實驗因素總量恒定時，單純形網格法僅需確定各因素比例范圍就可準確預測實驗區域內其他點的性能，被廣泛用于SMEDDS制劑處方優選[7]。與其他方法相比，單純形網格法可通過較少的實驗次數，確定最優處方，大大簡化了實驗操作，且預測性良好[10]。使用單純形網格法優化處方時，把粒徑、PDI、乳化時間作為參考因素，這是因為SMEDDS粒徑越小，比表面積越大，越容易被吸收；較小的PDI可保證乳液的分散性；乳化時間越短，自乳化過程越容易進行。總之，合適的粒徑、PDI、乳化時間可保證SMEDDS優良的體內外性質。

體外溶出試驗結果表明與C X B 原料藥相比，CXB-SMEDDS的溶出度大大提高，據此預測，CXB-SMEDDS可提高CXB的口服生物利用度。體外溶出試驗可以一定程度上預測藥物的體內行為，但體外溶出并不能完全模擬藥物的體內吸收情況，因此后續試驗還可以進行CXB-SMEDDS的藥動學試驗，通過測定CXB原料藥和CXB-SMEDDS的血藥濃度，進一步驗證CXB-SMEDDS確實能大大提高CXB的體內吸收[11]。同時，還可比較體內體外試驗的結果，進行體內外相關性研究。