雪蓮果葉UPLC-ECD指紋圖譜及其抗氧化活性成分研究

丁小倩，李姿瑤，王 艷，何 婷，陳榮祥，袁曉艷

（遵義醫科大學 藥學院 分析化學教研室，貴州 遵義 563099）

雪蓮果（Smallanthus Sonchifolius），又稱亞貢（yacon），是菊科Smallanthus屬多年生草本植物，原產于安迪斯山脈的中高原地帶，目前在日本、巴西、韓國、中國等多個國家均有引種，我國境內主要分布于云南、貴州、四川等地區[1]。研究表明，雪蓮果中含豐富的酚酸、黃酮和低聚果糖類成分[2-3]，該類成分被認為具有抗氧化、降血脂、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[4-5]。雪蓮果葉研究及應用較少，民間將其加工為飲料或糖漿用于降血脂及預防因自由基過剩引起的慢性疾病[6]。事實上酚酸黃酮類物質主要集中在雪蓮果的葉子中，Khajehei 等[7-8]的研究顯示，雪蓮果葉的總酚含量在(53.39±1.94) mg/g～(76.67±21.67) mg/g范圍內，遠高于其塊莖中的酚酸含量，因此雪蓮果葉具有較強的抗氧化能力。已有研究人員將其研制為清咽含片[9]，研究其降血糖含片工藝[10]、制茶工藝[11]，因而篩選雪蓮果葉的抗氧化成分有利于雪蓮果葉進一步開發應用。

電化學檢測器（electrochemical detector，ECD），用于選擇性檢測具有氧化還原性的物質，靈敏度高，能輔助篩選中藥中的抗氧化成分[12]，如帶有硝基、巰基、酚羥基等基團的有機化合物，因此適用于檢測含大量酚酸類成分的雪蓮果葉。前期研究發現，所建ECD分析方法得到的藥材譜圖中峰面積與其抗氧化能力具有相關性，同時圖譜中的成分均有較強的抗氧化能力[13-14]，因此采用ECD篩選抗氧化成分的方法具有可靠性。本研究通過UPLCECD法建立指紋圖譜，尋找雪蓮果葉抗氧化活性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀（配有MassLynx V.4.1工作站軟件，美國Waters）；Thermo UltiMate 3000 bio-RS超高效液相色譜儀（配有Chromeleon 7.2工作站，ECD-3000 RS電化學檢測器，賽默飛世爾）；SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝）；ME104E/02型電子天平（梅特勒-托利多）；ThermoST8R小型臺式離心機（賽默飛世爾）；埃爾格Purelab Chorus 2超純水系統（英國埃爾格）；Multiskan FC酶標儀（賽默飛世爾）。

1.2 試藥

雪蓮果葉藥材采集于四川、云南、貴州多個產地，具體信息見表1。經遵義醫科大學藥學院生藥學教研室張玉金副教授鑒定為菊科Smallanthus屬亞貢（Smallanthus Sonchifolius）的新鮮葉子。

表1 雪蓮果葉藥材來源

乙腈（色譜純，北京伊諾凱）；甲酸（分析純，賽默飛世爾）；無水乙酸鈉（分析純，重慶川東化工）；3, 7-二-O-甲基異槲皮苷對照品（HPLC純度≥98 %，成都埃法）；蘆丁，異槲皮苷，異綠原酸A對照品（HPLC純度≥98 %）以及福林酚，三氯化鐵六水合物，氫氧化鈉，無水碳酸鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，硫酸亞鐵七水合物，過硫酸鉀，冰乙酸，生育酚，檸檬酸鉀，2, 2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），4, 4’-二（1H-1, 2, 4-三唑-1-基）-1, 1’-聯苯（TPTZ），1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等試劑均為分析純（上海阿拉丁）。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 供試溶液制備 將10批新鮮雪蓮果葉置烘箱，50 °C烘干至恒重，取適量干燥雪蓮果葉，粉碎，分別稱取1 g粉末，加入70 %乙醇10 ml，超聲提取30 min，10 000 r/min離心5 min，取5 ml上清，用70 %乙醇定容至20 ml，0.22 μm濾膜過濾得樣品溶液。分別取10批藥材樣品溶液0.1 ml，混勻得混合樣品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液的配制 分別取蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸A對照品1 mg，用70 %乙醇定容至100 ml量瓶，得0.01 mg/ml混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：XBrigde BEH Shield RP18（3 mm×150 mm，2.5 μm）；流動相：0.1 %甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～14 min，95 %A～77 %A；14～24 min，77 %A～72 %A；24～32 min，72 %A～57 %A；32～37 min，57 %A～0 %A；37～39 min，0 %A～0 %A；39～43 min，0 %A～95 %A）；因ECD需要高濃度的鹽[15]，所以將100 mmol/L檸檬酸鉀溶液以0.1 ml/min的流速于色譜柱后，檢測器前的位置補充；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：3 μl；電化學檢測池電流：600 nA。

2.1.4 指紋圖譜分析方法 取2.1.1項下10批樣品溶液和2.1.2項下混合對照品溶液，按2.1.3項下色譜條件進樣檢測，記錄43 min的色譜圖。UPLC指紋圖譜見圖1，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）進行分析，得UPLC對照指紋圖譜（見圖2）。以UPLC對照指紋圖譜為參照圖譜，進行10批樣品的相似度評價，結果見表2，10批樣品的相似度在0.983～0.754之間。10批雪蓮果葉樣品共有12個共有峰，選取共有峰中分離度大，峰形好，峰面積適中的6號峰作為參照峰，計算其余峰的相對峰面積，結果見表3。

圖1 10批雪蓮果葉樣品UPLC-ECD指紋圖譜

圖2 雪蓮果葉UPLC對照指紋圖譜

表2 10批雪蓮果葉樣品相似度評價結果

表3 10批雪蓮果葉樣品UPLC圖譜共有峰相對峰面積

2.2 共有峰的鑒別

2.2.1 質譜條件 電噴霧離子源，負離子檢測模式下多反應監測模式檢測；毛細管電壓：3.5 kV；蒸發溫度：600 °C；氣流量：750 L/h。

2.2.2 鑒別方法及結果 根據對照品離子對并參考文獻中報道的離子對[16]，得化合物質譜參數，見表4。取2.1.2項下混合對照品溶液和2.1.1項下混合樣品溶液，按2.1.3項下色譜條件進樣檢測。通過對比UPLC-ECD混合對照品色譜圖（圖3）、UPLCECD指紋圖譜（圖1）、UPLC-MS所得混合樣品和混合對照品的圖譜（圖4、圖5），將1，6，7，8，9，11號峰分別指認為咖啡酰葡萄糖二酸、雙咖啡酰太洛黏酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸A和2, 3,5-或2, 4, 5-三咖啡酰太洛黏酸。

圖3 混合對照品UPLC圖譜

圖4 混合樣品UPLC-MS圖譜

圖5 混合對照品UPLC-MS圖譜

表4 UPLC-MS鑒定雪蓮果葉中的成分

2.3 聚類分析

采用SPSS 26軟件進行聚類分析。以10批藥材樣品12個共有峰的峰面積為變量，采用組間連接法，當歐式距離為12時，10批雪蓮果葉藥材可分為兩類，S5、S7為一類，S1～S4、S6、S8～S10為第二類，提示這兩類雪蓮果葉樣品存在質量差異，詳見圖6。

圖6 聚類分析樹狀圖

2.4 總酚含量分析

總酚含量的測定采用福林-酚比色法。分別取2.1.1項下供試品溶液0.5 ml，加入0.5 ml福林酚試劑（0.25 mol/L），反應3 min，加15 % Na2CO31 ml，混勻，反應30 min后，3500 r/min離心3 min，取上清，760 nm下測得吸光度。配制濃度為0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50 mg/L的沒食子酸標準曲線溶液，按上述方法測定，得回歸方程y=115.77x+0.074，R2=0.9988。總酚結果表示為每克雪蓮果葉中所含沒食子酸當量（mg/g），由結果可知，第一類雪蓮果葉S5、S7的總酚含量明顯高于第二類雪蓮果葉，詳見表5。此外，將Origin軟件中不同批次雪蓮果葉UPLC指紋圖譜的總峰面積和總酚含量結果進行線性回歸，發現二者呈正相關，說明在所采用的色譜條件下，ECD檢測器檢測到的主要化合物為酚酸類化合物。

表5 不同產地雪蓮果葉總酚含量測定結果

2.5 抗氧化活性成分

2.5.1 DPPH自由基清除實驗 DPPH自由基清除率的測定基于Abbas等[17]的方法并稍作修改。取適量DPPH，用80 %甲醇溶液溶解并稀釋至0.1 mg/ml，得DPPH工作液。取10批藥材粉末，加10倍量70 %乙醇（w/v），超聲提取30 min后得樣品溶液。樣品溶液S5、S7用80 %甲醇稀釋10倍，其余樣品溶液稀釋5倍后，分別取40 μl，用80 %甲醇稀釋至200 μl，混勻后加入DPPH工作液400 μl，搖勻，室溫下避光反應30 min，使用酶標儀在517 nm處測定溶液的吸光度，平行操作3次。結果見表6。

表6 抗氧化活性測定結果

2.5.2 ABTS+˙清除實驗 ABTS+˙清除能力測定參考Rajakumari等[18]的方法并稍作修改。取3.75 mg/ml ABTS溶液1.6 ml和0.67 mg/ml的過硫酸鉀溶液各3 ml，混合，室溫、避光條件下靜置反應12～16 h，制備成ABTS+˙儲備液。將ABTS+˙儲備液用水稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度在0.7～0.8之間，得ABTS+˙工作液。取10批藥材粉末，加10倍量70 %乙醇（w/v），超聲提取30 min后得樣品溶液，將S1、S2、S4、S6用水3:7（v/v）稀釋，S3、S8～S10用水稀釋5倍，S5、S7用水稀釋10倍。測定時取0，20，60，100，140，200 μl稀釋后的樣品溶液，加水稀釋至200 μl，搖勻，加400 μl ABTS+˙工作液，混勻后于室溫下反應30 min，734 nm波長處測定吸光度，重復操作3次。

2.5.3 Fe3＋還原能力實驗（FRAP實驗） Fe3＋還原能力參考Adedayo等[19]的方法并稍作修改。TPTZ溶液由5 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、9 mmol/L TPTZ工作液（用40 mmol/L鹽酸溶解，37 ℃提前預熱30 min）、20 mmol/L FeCl3溶液（10:1:1，v/v/v）組成，現配現用。取10批藥材粉末，加10倍量70 %乙醇（w/v），超聲提取30 min后得樣品溶液，分別用水稀釋30倍，準確量取100 μl樣品稀釋液，加入300 μl TPTZ工作液，混勻后反應5 min，于593 nm波長處測定吸光度，重復操作3次。

DPPH、ABTS、TRAP實驗結果均表示為生育酚當量。DPPH自由基清除實驗中標準曲線擬合為y=-0.0202x+0.817，R2=0.9918；ABTS+˙清除實驗中標準曲線擬合為y=-0.0217x+1.3891，R2=0.9958；FRAP實驗中標準曲線擬合為y=0.0396x+0.0489，R2=0.9998。抗氧化活性測定結果詳見表6 。

2.5.4 灰色關聯度分析 參考文獻[20]方法，采用均值法對10批樣品的抗氧化結果進行無量綱化處理，將雪蓮果葉抗氧化結果作為母序列[記為Y(k)]，共有峰峰面積作為子序列[記為X(k)]，按下式計算母序列與子序列的關聯度系數[p(k)]。

式中ρ為分辨系數，通常情況下取0.5；Δ(k)為母序列與子序列差的絕對值；Δ(k)min為第二級最小差；Δ(k)max為第二級最大差。

按下式計算關聯度。

式中，n為樣品數量。

采用SPSS軟件計算得灰色關聯度，12個共有峰的關聯度均大于0.6，詳見表7、表8。

表7 灰色關聯母序列及子序列

表8 雪蓮果葉12種共有成分抗氧化活性與峰面積的關聯度

抗氧化活性檢測中S5和S7清除DPPH自由基的能力高出其余批次1.69～5.47倍，清除ABTS+˙能力高出3.26～9.08倍，Fe3+還原能力高出2.19～9.47倍，說明第一類雪蓮果葉質量較好，抗氧化能力優于第二類。

在灰色關聯分析中，關聯度R介于0～1之間，該值越大代表其與母序列之間的相關性越強，當R>0.6時，表示該成分與藥效指標有關聯性，當R>0.8時，表示該成分與藥效指標有較大關聯性[21]。在灰色關聯分析結果中，12個共有峰的關聯度均大于0.6，說明ECD所建指紋圖譜中所有共有成分均具有抗氧化能力，再次證明了使用ECD篩查抗氧化成分的有效性和可靠性。

3 討論

本研究建立了10批雪蓮果葉的UPLC-ECD指紋圖譜，并結合UPLC-MS鑒定出6種成分。聚類分析結果顯示，10批雪蓮果葉樣品可分為兩類，S5、S7為第一類，其余樣品為第二類，結合總酚結果和抗氧化結果可知，第一類雪蓮果葉的總酚含量高于第二類，抗氧化能力也高出第二類，證明第一類雪蓮果葉的質量優于第二類。前期研究中曾使用PDA 2695、DAD等紫外檢測器，但所得譜圖復雜，有諸多雜峰，且分析時間長。本文采用的方法具有選擇性，能大幅改善上述情況，即通過ECD突出的篩選能力，僅留下抗氧化成分，從而使圖譜簡化，分析時間縮短。本實驗中不同批次雪蓮果葉總酚的含量與其對應的色譜圖總峰面積具有相關性，同時灰色關聯度分析結果顯示12個共有峰與抗氧化活性均具有相關性，證明了該方法的有效性與可靠性。

綜上，所建ECD篩選分析方法能有效篩選藥材中的抗氧化成分，所建指紋圖譜及聚類分析可用于雪蓮果葉的質量評價。