普通煙草NtIAA13b基因的克隆及功能分析

喻奇偉，朱紫童，何軼*，曹廷茂，康俊，羅貞寶，李磊磊，戴彬，李鵬志，高冬冬，吳學巧，賈宏昉*

1.貴州省煙草公司畢節市公司，貴州省畢節市七星關區南嶺路519號 551700

2.河南農業大學煙草學院，鄭州市鄭東新區平安大道218號 450002

鉀作為植物生長過程中不可或缺的礦質營養元素，能夠參與碳、氮代謝等生命活動，同時，植物對鉀的吸收水平會影響自身的抗病和抗逆能力［1］。煙草是中國重要的經濟作物。然而，中國煙葉的鉀含量普遍低于優質煙葉鉀含量的最低標準，故在農業生產中適當提高煙草中的鉀含量不僅能夠滿足其生長發育的需求，提高煙葉品質，而且能夠有效降低煙草中焦油及其他有害物質的含量［2］。植物主要通過鉀轉運蛋白和鉀離子通道蛋白實現對鉀的吸收與利用，目前在煙草中已有多個鉀轉運蛋白基因（HAK11、HAK5等）和鉀離子通道蛋白基因（AKT1、TPK1等）被鑒定發現并且已經進行了功能驗證［3-6］。除了鉀轉運蛋白和鉀離子通道蛋白基因以外，還有許多上游基因通過調控鉀轉運蛋白和鉀離子通道蛋白基因的表達參與鉀的吸收與利用過程［7-8］，如擬南芥中生長素響應因子AtARF2可通過調控HAK5基因的表達影響鉀吸收［9］，說明生長素相關基因在鉀的吸收與利用過程中可能也發揮著重要作用。

Aux/IAA基因家族是生長素誘導相關基因家族，其編碼的蛋白質能夠通過與生長素響應因子（Auxin response factors，ARFs）結合調控ARF家族基因的表達。關于Aux/IAA基因家族成員的研究主要集中在擬南芥、水稻和小麥3種植物中［10］，目前已分別鑒定出29個［11］、31個［12］和84個［13］Aux/IAA家族成員，但大多數成員的功能都與植物根、莖、葉和果實的生長發育有關，只有少部分成員的功能與植物響應非生物脅迫有關。如Jung等［14］通過轉基因技術創制過表達株系，同時對野生型株系與過表達株系進行干旱脅迫處理，發現OsIAA6基因過表達株系的抗旱能力明顯增強；Salehin等［15］通過基因編輯技術創制基因敲除株系，同時對野生型株系與基因敲除株系進行干旱脅迫處理，發現AtIAA5、AtIAA6或AtIAA19基因敲除后植株的抗旱能力均明顯下降；Jain等［16］通過對水稻進行鹽脅迫處理，發現水稻OsIAA9基因和OsIAA20基因的表達量在高鹽脅迫條件下明顯上調。然而，目前對Aux/IAA家族基因在植物對鉀吸收與利用過程中作用的研究還鮮見報道，煙草中已經鑒定出了77個Aux/IAA家族成員，但大多數成員的功能還尚不明確［17］。因此，克隆Aux/IAA家族基因NtIAA13b，利用qRT-PCR、亞細胞定位和轉基因等技術對該基因進行系統分析，旨在進一步探究Aux/IAA家族基因響應非生物脅迫的功能，揭示煙草NtIAA13b基因在鉀吸收與利用過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試材料培養

將普通烤煙品種K326采用Hoagland水培法培養在人工氣候箱內，光照強度、光照周期、相對濕度和溫度分別設置為300 μmol·m-2·s-1、16 h/8 h（光/暗）、60%、28℃/22℃（光/暗），培養14 d，選取長勢一致的煙株。

1.1.2 不同營養液配方

全營養液：5 mmol/L NaNO3；1 mmol/L NaH2PO·42H2O；1 mmol/L K2SO4；0.75 mmol/L CaCl2·2H2O；0.5 mmol/L MgSO4·7H2O；9 μmol/L MnCl2·4H2O；0.03μmol/L（NH4）2MoO4；46μmol/L H3BO3；8μmol/L ZnSO4·7H2O；3 μmol/L CuSO4·5H2O；20 μmol/L FeSO4·7H2O和Na2-EDTA螯合物。低氮處理營養液：將全營養液中NO3-濃度調整為0.25 mmol/L；低磷處理營養液：將全營養液中PO43-濃度調整為0.05 mmol/L；低鉀處理營養液：將全營養液中K+濃度調整為0.1 mmol/L；低鈣處理營養液：將全營養液中Ca2+濃度調整為0.05 mmol/L；低鎂處理營養液：將全營養液中Mg2+濃度調整為0.05 mmol/L。

1.2 樣品采集方法

將1.1.1中長勢一致的煙株進行不同非生物脅迫（低氮、低磷、低鉀、低鈣、低鎂）處理，并以全營養液處理作為對照（CK），7 d后不同處理分別選取3株幼苗，重復3次，用于檢測NtIAA13b基因的表達量。不同處理分別選取3株幼苗，將根、莖、葉3個部位分別取樣，重復3次，用于分析NtIAA13b基因的組織表達特性。

1.3 目的基因的克隆

使用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit試劑盒（上海普洛麥格公司）提取煙草的總RNA，測定所提總RNA的OD260/280值，并用1.2%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。使用HiScript?Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊公司）進行反轉錄試驗，獲得cDNA產物。采用Primer Premier 5.0軟件設計試驗所需要的擴增引物，以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增目的基因的條件如下：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃保溫10 min。再利用DNA連接酶把擴增得到的目的片段與中間載體pMD19-T相連，測序驗證工作由武漢伯遠生物科技有限公司完成，最終得到全長cDNA序列信息。

1.4 序列分析方法

使用NCBI網站的ORF finder在線分析工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行基因序列的蛋白質翻譯；使用NetPhos 2.0在線分析工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測NtIAA13b蛋白質的磷酸化位點；使用DNAMAN軟件將NtIAA13b與擬南芥、白樺、番茄等植物中已鑒定出的Aux/IAA家族蛋白做同源性比對；使用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹［18］。

1.5 啟動子分析

登錄茄科網站（https://solgenomics.net/），以煙草NtIAA13b基因全長序列作為探針，使用Blast在線工具搜索基因全長序列，選取NtIAA13b基因起始密碼子（ATG）上游2 000 bp的核苷酸序列用于啟動子分析，通過PlantCARE網站（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對目標基因啟動子區的順式作用元件進行鑒定分析。

1.6 亞細胞定位分析

將沒有末端密碼子的NtIAA13b cDNA融合到pBWA（V）HS載體中綠色熒光蛋白（GFP）基因的N末端，獲得融合載體pBWA（V）HS-NtIAA13b-GLosgfp，將未插入NtIAA13b基因的pBWA（V）HS-GLosgfp空載體作對照。通過注射法導入葉片組織，然后將轉化的煙草表皮樣品在25℃避光保存16 h。通過共聚焦激光掃描顯微鏡監測GFP的瞬時表達部位［19］。

1.7 基因表達分析

根據RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（美國賽默飛公司）的說明書逐步進行實時熒光定量PCR試驗，實時熒光定量的試驗數據使用煙草組成型表達基因NtL25（GenBank：L18908.1）作為內參基因進行3次重復試驗，并使用2-ΔΔCT算法加以分析。假定脅迫處理后目的基因表達量是CK處理的N倍，N=2-ΔΔCT，ΔΔCT=Treat（CT樣品-CTL25）-CK（CT樣品-CTL25）［20］。

1.8 pCAMBIA13.5 -NtIAA13b過表達載體構建及遺傳轉化

基于基因克隆測序無誤的NtIAA13b基因序列，設計并構建NtIAA13b基因過表達載體（NtIAA13b-OX）的引物，并利用測序無誤的NtIAA13b cDNA克隆為模板擴增NtIAA13b基因的完整序列（XM_016607561.1），在pCAMBIA1305載體上接入PCR產物，獲得過表達載體pCAMBIA1305-NtIAA13b。采用電轉化的方法，將過表達載體轉入農桿菌GV3101感受態細胞中，篩選出陽性克隆，并使用篩選結果為陽性的菌液侵染煙草K326植株［21］進行收種，獲得轉基因材料T0代種子，繼續繁育獲得T2代純合種子。

1.9 NtIAA13b基因過表達株系的生理功能驗證

將1.8中獲得的過表達（OX）T2代純合煙草種子和過表達材料的野生型煙草（K326）種子經Hoagland水培法培養30 d后，各取3株幼苗并將所有葉片剪下，檢測葉片中的鉀含量，將剩余幼苗進行盆栽培養，現蕾期進行打頂，打頂后7 d分別取過表達植株（15株）和煙草K326植株（15株）的上部葉、中部葉和下部葉，殺青后測定鉀含量。

1.10 數據分析

使用DPS 7.0軟件進行完全隨機單向測試的試驗統計分析，采用LSD法進行多重對比分析，并對結果進行不同標記，綜合數據與分析結果運用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 NtIAA13b基因的PCR擴增結果

以煙草根系的cDNA為模板，通過瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，結果如圖1所示。該基因全長在750～1 000 bp之間，使用NCBI網站ORF finder在線工具分析，發現該基因全長879 bp，可編碼292個氨基酸，暫將其命名為NtIAA13b。

圖1 NtIAA13b全長基因的PCR擴增電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification of full-length NtIAA13b

2.2 NtIAA13b蛋白質生物信息學分析

由圖2可見，NtIAA13b基因全長879 bp，編碼292個氨基酸，相對分子質量為31.71 kD，理論等電點為6.48。編碼酸性氨基酸41個，堿性氨基酸40個。分子式為C1371H2200N390O445S14，NtIAA13b蛋白的不穩定指數為24.90，屬于穩定蛋白，該蛋白二級結構中α螺旋結構占28.08%，延伸鏈占21.92%，無規則卷曲占40.07%，β折疊結構占9.93%。NtIAA13b蛋白的氨基酸序列中包含16個絲氨酸、12個蘇氨酸和3個酪氨酸，在這些位點可能發生磷酸化。

2.3 NtIAA13b基因同源序列比對及進化分析

通過NCBI網站查詢煙草、番茄和擬南芥等植物Aux/IAA家族的蛋白質序列，并通過DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對（圖3），發現克隆得到的NtIAA13b與擬南芥AtIAA13的同源性為48.31%，與SlIAA13的同源性為83.11%。通過MEGA 6.0軟件構建系統進化樹，發現NtIAA13b與番茄SlIAA13的親緣關系最近（圖4）。

圖3 氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homology analysis of amino acid sequences

圖4 系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree

2.4 NtIAA13b基因啟動子元件分析

由圖5可知，NtIAA13b基因啟動子區域除了包含基本元件TATA-box和CAAT-box外，還有1個參與防御和應激響應的順式作用元件（TC-rich repeats）、3個防衛和脅迫響應順式作用元件（MYB）、1個赤霉素響應元件（P-box）、1個生長素響應元件（TGA-element）和1個參與厭氧誘導的調控元件（ARE）。其中，植物生長素響應元件（TGA-element）可以促進或抑制植物生長素誘導基因的表達。此外，在脅迫條件下防衛和脅迫響應元件（MYB）能夠誘導脅迫相關基因表達，導致相關基因的瞬時表達量上調。

圖5 NtIAA13b基因的啟動子元件分析Fig.5 Sequence element analysis of promoters of NtIAA13b

2.5 NtIAA13b亞細胞定位分析

通過共聚焦激光掃描顯微鏡監測GFP的瞬時表達，發現NtIAA13b蛋白定位于細胞核中（圖6）。

圖6 NtIAA13b蛋白的亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of NtIAA13b

2.6 NtIAA13b基因的表達特性

2.6.1 不同非生物脅迫下NtIAA13b基因的表達特性分析

為檢測NtIAA13b基因在不同非生物脅迫處理下的表達情況，分別用低氮、低磷、低鉀、低鈣和低鎂5種非生物脅迫對煙草K326幼苗進行處理采樣，qRT-PCR結果（圖7A）表明，NtIAA13b基因在低鉀脅迫下的相對表達量極顯著高于CK條件下的相對表達量，說明低鉀脅迫可以使NtIAA13b基因的表達量上調。

圖7 NtIAA13b基因在不同非生物脅迫和不同組織中的表達模式Fig.7 Expression patterns of NtIAA13b in different tissues under different abiotic stresses

2.6.2 NtIAA13b基因的組織表達特性分析

為分析NtIAA13b基因在煙株不同部位的表達特性，通過qRT-PCR技術檢測正常處理下不同組織部位NtIAA13b基因的相對表達量，發現NtIAA13b基因在煙草根、莖、葉中均有表達，其中根中表達量最高（圖7B）。

2.7 NtIAA13b基因過表達對植株葉片鉀含量的影響

通過轉基因技術獲得10個過表達的煙草株系，從中篩選兩個NtIAA13b基因表達量較高的植株（OX1和OX9），觀察OX1和OX9的表型，發現其煙株發育表型與煙草K326（WT）無顯著差異（圖8B）。檢測煙草K326植株與NtIAA13b基因過表達煙草植株在正常供鉀條件下葉片中的鉀含量，發現在正常供鉀條件下，NtIAA13b基因過表達煙草植株葉片中的鉀含量顯著高于煙草K326植株（圖8C），說明過表達NtIAA13b基因可以增加煙草葉片中的鉀含量，提高煙草對鉀的吸收與利用水平。為進一步明確NtIAA13b基因在鉀吸收與利用中的作用，通過盆栽試驗，分析了OX1和OX9打頂后上、中、下3個部位葉片的鉀含量（圖8D），結果顯示NtIAA13b基因過表達煙草植株在正常供鉀生長條件下，其上、中、下部位葉片鉀含量均高于煙草K326植株。

圖8 NtIAA13b基因過表達植株的表型及其葉片中的鉀含量Fig.8 Phenotype of NtIAA13b-overexpressed plants and potassium content in their leaves

3 討論

首次從煙草K326中克隆出NtIAA13b基因，該基因全長879 bp，編碼292個氨基酸。通過生物信息學分析發現，NtIAA13b基因編碼的蛋白質NtIAA13b與番茄SlIAA13的親緣關系最近，推測二者可能具有相似的功能。NtIAA13b基因啟動子包含多個防衛、防御、脅迫響應和應激響應的順式作用元件，生長素、赤霉素響應元件和參與厭氧誘導的調控元件，推斷該基因可能響應非生物脅迫，并且能夠影響生長素相關基因表達。亞細胞定位結果顯示，NtIAA13b基因編碼蛋白主要定位在細胞核，植物蛋白質的亞細胞定位結果可以暗示其功能特性［22］。由于轉錄因子調控基因轉錄的過程發生在細胞核中，故推測定位于細胞核上的NtIAA13b蛋白屬于轉錄調控因子。

對NtIAA13b基因在煙草不同組織中的表達水平進行分析，結果顯示，NtIAA13b基因在根、莖和葉中均有表達，其中根中表達量最高，葉中最低，各組織表達量之間存在差異。通過進一步分析NtIAA13b基因在煙草缺鉀條件下的表達量水平，結合啟動子順式作用元件分析結果，推測NtIAA13b基因參與了低鉀脅迫下鉀的吸收與利用。通過對比煙草K326植株與NtIAA13b基因過表達植株在正常供鉀條件下葉片中的鉀含量，發現過表達植株中的鉀含量更高，說明過表達該基因能夠顯著增強葉片中的鉀含量。推測NtIAA13b基因可能通過和ARF家族基因成員互作，間接調控下游鉀吸收相關靶基因，從而參與煙草鉀的吸收與利用。因此，在后續的研究中，可以通過酵母雙雜交、BiFC等技術進一步深入解析NtIAA13b基因的互作蛋白，明晰NtIAA13b基因調控鉀吸收與利用的分子機制。

4 結論

在煙草中克隆了NtIAA13b基因，研究了NtIAA13b的蛋白質結構、同源性和亞細胞定位，發現該蛋白定位在細胞核，可能是一個轉錄調控因子。啟動子順式元件分析與基因的表達模式分析結果顯示NtIAA13b基因的啟動子區域含有與響應非生物脅迫相關的順式作用元件，NtIAA13b基因能夠響應低鉀脅迫表達量上調至正常條件下的2.5倍，且NtIAA13b基因在不同組織部位的表達量存在差異，在根中表達量較高。過表達NtIAA13b基因能夠提高葉片中的鉀含量，結合啟動子元件分析結果，可以說明NtIAA13b基因能夠響應非生物脅迫反應并且參與煙草中鉀的吸收與利用過程。