烤煙Y2001多腺毛改良株系的創制及抗性分析

羅銳，王召軍，滕環瑜，張博凱，高嘉寧，田濤，閆筱筱，崔紅*

1.河南農業大學煙草學院，鄭州市鄭東新區平安大道218號 450046

2.河南中煙工業有限責任公司，鄭州市管城回族區經開第三大街9號 450000

煙草表面密布表皮毛，根據其有無分泌能力可以分為分泌型表皮毛和非分泌型表皮毛［1］。其中，分泌型表皮毛又稱腺毛，根據其柄細胞數目的多少又分為長柄腺毛和短柄腺毛［2］。腺毛產生的次生代謝物質是煙草葉面化學成分的重要組成部分［3］。煙草腺毛分泌物主要由二萜類和糖酯等化合物構成［4］。其中，西柏烷類二萜占腺毛分泌物的大部分，主要以西柏三烯一醇和二醇的形式存在［5］。腺毛分泌物對煙葉香氣品質至關重要，西柏烷類二萜可降解產生茄酮以及茄酮降解產物，是煙草重要的中性香氣物質，具有改善煙氣香氣和吸味的作用［6-7］。蔗糖酯是卷煙燃吸時的重要香氣前體物質，同時也是后期卷煙加工的保潤劑［8］。此外，腺毛分泌物在煙株應對環境脅迫過程中也發揮著重要作用，例如分泌物對蚜蟲等害蟲有明顯的趨避及毒殺作用［9-10］，有效抑制了以昆蟲為媒介的病害的傳播［11］。同時，腺毛分泌物對真菌孢子囊生長也有抑制作用［12-13］。因此，提高腺毛密度及分泌物含量是煙草育種的重要目標之一。

近年來，植物表皮毛發生相關基因的研究在多種模式植物中越來越深入［14］，許多重要調控基因被鑒定出來，例如在番茄中的研究發現了1個B型細胞周期蛋白SlCycB2［15］，過表達SlCycB2能夠顯著降低番茄表皮毛密度，而SlCycB2 RNAi植株的表皮毛密度則顯著增加［16］。對本氏煙草中的同源基因NbCycB2的研究也證明該基因是腺毛發生的負調控基因［17］。孟盈等［18］、潘陽等［19］對普通煙草中的B型細胞周期蛋白基因的同源基因NtCycB2研究也發現，NtCycB2基因敲除后，腺毛密度及腺毛分泌物顯著提高，烤后煙葉中性致香物質的積累量也顯著提高。此外，NtCycB2基因敲除后植株生長發育正常，對鹽［20］、干旱［21］、蚜蟲［22］等脅迫的抗性也明顯提高。說明NtCycB2是進行腺毛密度及分泌物含量定向改良的理想基因。中煙100是豫中濃香型煙區的主栽品種，因產量高、易烘烤、耐肥性強等特點在生產上得到廣泛應用。李艷華等［23］對其腺毛觀察發現，與K326等優質烤煙品種相比，中煙100葉面非分泌型表皮毛比例偏高，導致分泌物含量較低，推測可能對烤后煙葉香氣不利。為此，課題組前期選育出了分泌型腺毛比例較高的改良品種Y2001［24］，其香氣品質優于中煙100，且保留中煙100的優異農藝性狀。Y2001的選育表明通過腺毛定向改良能夠提高煙葉的香氣品質，由此推測提高Y2001腺毛密度及分泌物含量有望進一步提高煙葉的香氣品質。但高腺毛密度對Y2001的生物及非生物脅迫抗性是否也會產生影響，目前還鮮見研究報道。因此，采用EMS誘變創制了Y2001 NtCycB2基因突變體，并以該突變體為供體親本，Y2001為輪回親本，進行連續回交和自交，結合分子標記輔助選擇、腺毛觀察、腺毛分泌物測定，得到了多腺毛Y2001定向改良株系HY2001，并對其干旱、黑脛病和蚜蟲脅迫抗性進行分析，旨在明確高腺毛密度煙草株系抗性的優劣，為豫中濃香型煙葉產區品種改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為Y2001，將Y2001裸種用清水洗凈后采用0.8%（質量分數）甲基磺酸乙酯（EMS）處理，于人工氣候室中進行培養。培養條件：光照14 h、28℃，黑暗10 h、24℃，光暗交替，相對濕度60%。

1.2 NtCycB2基因突變體的篩選

將EMS處理后的Y2001種子（M0）采用漂浮育苗培養至四葉一心期，共獲得1 716株成活幼苗。采用CTAB法分別提取各單株的DNA，隨后將提取的DNA按照10株1組進行等量混合，形成DNA混池，并根據NtCycB2基因序列設計特異性擴增引物NtCycB2（表1），對所有DNA混池及野生型Y2001基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行測序，篩選含有序列突變的混池，并對混池中的各個單株分別測序，最終確定突變單株。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1.3 NtCycB2基因突變檢測分子標記的開發

根據突變體中NtCycB2基因序列的突變位點，開發了特異性檢測標記MT（表1），該標記能夠在含有突變位點的單株基因組DNA中擴增出條帶。但該標記為顯性標記，無法區分純合單株和雜合單株，為此又針對野生型序列開發了特異性檢測標記WT（表1），該標記能夠在含有野生型序列的單株基因組DNA中擴增出條帶。分別使用MT與WT引物對待測植株DNA進行擴增，僅有MT能擴增出條帶，即為NtCycB2基因純合突變單株。

1.4 多腺毛Y20.1 改良株系的創制

以篩選得到的NtCycB2基因突變體（M0代雜合單株）為供體親本，Y2001為輪回親本進行連續回交，每個世代均利用分子標記輔助選擇NtCycB2基因雜合突變的單株進行下一輪回交，為加快回交進程，回交過程采用誘導早花技術進行室內加代［25］。進行4次回交后自交得到BC4F2，在BC4F2代中篩選NtCycB2基因純合突變單株，進行腺毛表型觀察及分泌物檢測，并利用煙草全基因組SNP芯片進行遺傳背景回復率的檢測。煙草葉片用液氮速凍后，送至中國煙草總公司鄭州煙草研究院國家煙草基因研究中心進行SNP芯片檢測。候選單株自交收獲種子，所得BC4F3代作為候選改良株系HY2001（圖1）。

圖1 HY2001的創制過程Fig.1 Creation process of HY2001

1.5 腺毛形態觀察

在煙苗四葉一心期，選用同一葉位發育正常、大小一致的葉片，置于0.2%（質量體積分數）的羅丹明B水溶液中浸染30 min，染色結束后用蒸餾水漂洗3次，沖洗掉未結合的染料。用濾紙吸干葉表面水分后，置于超景深顯微鏡（VHX5000，日本基恩士公司）下進行腺毛觀察，并在上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛形態觀察及密度統計。

1.6 腺毛分泌物分析

于煙苗十葉一心期，取同一葉位發育正常、大小一致的葉片進行分泌物的提取和檢測，樣品制備以及前處理參考韓錦峰等［26］的方法。從葉片上截取直徑為5 cm的葉圓片，每50個葉圓片作為1個生物學重復，每個材料設置3次生物學重復。將葉圓片在二氯甲烷溶液中浸提，每個葉圓片浸提8次，每次2 s。在浸提液中加入1 mL內標（2.020 mg·mL-1的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg·mL-1的正十七烷醇的混合溶液），混合均勻后進行過濾，過濾后利用旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）濃縮，經硅烷化處理后利用氣相色譜質譜聯用儀TRACE GC Ultra-DSQ IIMS（美國賽默飛世爾科技公司）進行檢測，色譜檢測參數參考王霄龍等［27］的方法。采用內標定量法（相對校正因子為1）進行定量分析。

1.7 基因表達水平測定

于煙苗四葉一心期，選取中煙100、Y2001與HY2001從上至下第2葉位葉片，按照植物總RNA提取試劑盒［DP423，天根生化科技（北京）有限公司］說明書提取總RNA，反轉錄為cDNA，以煙草L25核糖體蛋白基因為內參基因，采用熒光定量PCR方法，對二萜合成基因NtCYP71D16、NtCBTS、NtABS以及糖酯類合成相關基因NtASAT1、NtASAT2進行表達量分析，中煙100、Y2001與HY2001均設置3次生物學重復。引物序列如表1所示。

1.8 干旱脅迫抗性分析

將Y2001與HY2001裸種置于鋪有濕潤濾紙的培養皿上，于人工氣候室中培養至兩片子葉后，小心移栽至相同大小的培養缽中，并于煙苗生長至四葉一心期時停止澆水，模擬自然干旱脅迫并進行表型觀察。干旱處理15 d后，分別取干旱處理和未進行處理的煙株從上至下第2葉位葉片，使用臺盼藍（Trypan Blue）和硝基四氮唑藍（NBT）染色并進行死細胞數量和活性氧狀況觀察，具體操作參照關揚揚等［21］的方法。使用試劑盒（北京索萊寶公司）測定干旱處理及未處理的煙株從上至下第3葉位葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及過氧化物酶（POD）的活性，具體操作按照試劑盒說明書進行。均設置3次生物學重復。

1.9 黑脛病抗性分析

疫霉菌（Phytophthora nicotiana）由河南省農業科學院煙草研究所提供，病菌首先使用燕麥培養基培養［28］，待菌絲鋪滿整個平板后，方可使用。

選用六葉一心期的壯苗，Y2001與HY2001均設置6次生物學重復。采用針刺法［29］進行疫霉接種，使用無菌注射器針尖在莖部制造傷口，使用打孔器在培養好疫霉菌絲的培養基上打取直徑5 mm的圓形菌餅，菌絲面朝傷口放置，用浸濕無菌水的脫脂棉覆蓋菌餅，保持菌絲生長所需水分，再用保鮮膜覆蓋脫脂棉防止水分過快揮發，在完成接種后，每天揭開保鮮膜噴水保持其濕度。在接種后第7天，根據國家標準GB/T 23222─2008［30］對Y2001和HY2001的發病程度進行調查，并取感病莖部發病及未發病交界處組織保存于-80℃，提取RNA后進行抗病相關基因表達量分析（Y2001和HY2001均設置3次生物學重復），引物序列見表1。

1.10 蚜蟲抗性分析

離體葉片蚜蟲選擇試驗：選取四葉一心期、大小一致的葉片，用脫脂棉包裹葉柄，Y2001與HY2001各選擇3片葉作為3次重復，放置于鋪好濾紙的培養皿中，所有葉片與培養皿中心距離相等，在培養皿中心放置50頭蚜蟲，使蚜蟲進行自然選擇，每2 h統計蚜蟲數量，連續統計12 h。

蚜蟲繁殖試驗：選取四葉一心期的Y2001與HY2001煙苗放置于光照培養箱中，每株接種20頭蚜蟲，用防蟲網與外界隔離，設置3次生物學重復，每3 d統計1次蚜蟲數量，共統計5次。

1.11 數據處理

使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，使用Microsoft Excel軟件計算平均數及標準差，使用SPSS 17.0軟件進行ONE WAY ANOVA分析。采用Student's t-test進行兩組數據間比較，采用LSD法進行多組數據間的差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 多腺毛Y20.1 改良株系的創制

對野生型Y2001中的NtCycB2基因進行測序，發現其序列與已經發表的K326中的序列完全一致［18］，說明Y2001中NtCycB2基因沒有發生突變。通過混池測序，成功篩選得到了1個NtCycB2基因雜合突變單株，該突變單株中NtCycB2基因的1條拷貝在37～85 bp處共發生了36個堿基缺失，以及5個堿基替換（圖2A），針對序列突變設計了特異性檢測標記MT（表1）。以該突變單株為供體親本，Y2001為輪回親本，連續回交4代，之后自交2代，結合分子標記輔助選擇（圖2B）、腺毛表型觀察及分泌物檢測，最終得到了NtCycB2基因純合突變的多腺毛Y2001改良株系HY2001（圖1）。

圖2 HY2001幼苗植株形態及分子標記輔助篩選Fig.2 Plant morphology and molecular marker assisted selection of HY2001 seedlings

對室內植株形態觀察發現（圖2C、圖2D），與中煙100相比Y2001和HY2001葉片狹長，葉面褶皺，葉邊緣呈波浪形。

利用煙草全基因組SNP芯片對HY2001進行背景回復率檢測，結果（圖3）表明HY2001與Y2001的遺傳背景相似度為97.86%。

圖3 HY2001遺傳背景分析Fig.3 Genetic background analysis of HY2001

2.2 多腺毛Y20.1 改良株系腺毛密度分析

腺毛形態觀察與腺毛密度統計結果見圖4。從圖4中可看出，中煙100、Y2001和HY2001葉片上同時存在長柄腺毛、短柄腺毛和非分泌型表皮毛。但中煙100非分泌型表皮毛所占有比例較高，而Y2001和HY2001主要由長柄腺毛構成，且HY2001不僅分泌型腺毛的比例提高，腺毛密度也明顯增加，其中長柄腺毛的密度增加最明顯，并且部分長柄腺毛存在分支現象，腺頭飽滿，發育完善，染色較中煙100與Y2001加深。從腺毛密度統計結果可以看出，與中煙100相比，HY2001長柄腺毛增加2.68倍，短柄腺毛提高1.71倍，非分泌型表皮毛降低34%，腺毛比例得到優化且腺毛密度顯著提高。與Y2001相比，HY2001長柄分泌型腺毛密度增加97%，短柄分泌型腺毛提高76%，非分泌型表皮毛比例也有所增加。

圖4 中煙100、Y2001與HY2001的腺毛觀察及密度統計Fig.4 Observation and density statistical analysis of trichomes of Zhongyan 100，Y2001 and HY2001

2.3 多腺毛Y20.1 改良株系腺毛分泌物含量分析

對中煙100、Y2001與HY2001葉片腺毛分泌物進行萃取并進行GC/MS檢測，結果見圖5。從圖5中可以看出，中煙100、Y2001與HY2001的分泌物組分一致，均由西柏烷二萜和I、II型蔗糖酯構成（圖5A）。從含量來看，Y2001相較于中煙100各組分含量均顯著提高；而HY2001中各組分含量顯著高于Y2001，其中西柏烷類二萜化合物含量分別為中煙100和Y2001的3.03倍和1.98倍，蔗糖酯含量分別為中煙100和Y2001的3.43倍和2.63倍，這與腺毛密度的顯著提高有關。

圖5 中煙100、Y2001與HY2001腺毛分泌物含量分析Fig.5 Secretion contents of trichomes of Zhongyan 100，Y2001 and HY2001

2.4 腺毛分泌物合成相關基因表達分析

中煙100、Y2001及HY2001中的二萜合成基因NtCYP71D16、NtCBTS、NtABS及蔗糖酯合成基因NtASAT1、NtASAT2的表達量測定結果如圖6所示。5個腺毛分泌物合成相關基因的表達均發生不同程度的上調。其中與二萜合成相關的NtCYP71D16、NtCBTS與NtABS表達水平相較于中煙100和Y2001均顯著提高，這一結果與二萜類化合物增長相符合。同時糖酯合成相關基因NtASAT1、NtASAT2的表達量也有一定的上調，分別是中煙100與Y2001的3.18倍和1.31倍、1.90倍和1.63倍，這與葉面分泌物中蔗糖酯含量結果一致。

圖6 中煙100、Y2001與HY2001腺毛分泌物合成基因表達水平分析Fig.6 Expression levels of trichome secretion biosynthesis related genes in Zhongyan 100，Y2001 and HY2001

2.5 干旱脅迫抗性分析

圖7結果顯示，干旱處理15 d時，Y2001中部以及下部葉片變黃萎蔫嚴重，僅上部葉片萎蔫較輕，生長狀態較好；而HY2001只有靠近下部葉片萎蔫，輕微變黃，上部葉片狀態良好（圖7A）。對干旱過程中細胞氧化損傷程度進行了Trypan Blue染色及NBT染色觀察死細胞及活性氧積累狀況發現，兩種染色條件均為HY2001染色最淺（圖7B），說明HY2001受到的氧化損傷較輕?？寡趸富钚苑治鼋Y果（圖7C）顯示，干旱處理0 d的Y2001和HY2001的抗氧化酶活性相近，干旱處理15 d的葉片組織內的抗氧化酶活性均升高，但HY2001體內抗氧化酶活性明顯高于Y2001，說明HY2001能更好地抵御干旱所帶來的細胞氧化損傷。

圖7 Y2001和HY2001干旱脅迫植株生長狀況及氧化損傷程度比較Fig.7 Comparison of plant growth status and oxidative damage degree between Y2001 and HY2001 under drought stress

2.6 黑脛病抗性分析

將制備好的煙草疫霉菌菌餅分別接種于Y2001與HY2001煙苗莖基部。在接種后的第7天，Y2001植株呈現萎蔫狀態，莖部呈枯木狀，黑脛病斑環繞莖圍，葉片呈凋萎狀，靠近下部葉片也有病斑出現，且根部有腐爛的跡象，而HY2001植株整體狀態較好，莖部病斑未達到莖圍二分之一，且只有下部一片葉輕度凋萎，根部狀態完好（圖8A、圖8C）。分別將Y2001和HY2001的莖基部患病部分剖開，發現Y2001莖部發生黑色病變，髓部干縮呈碟片狀，失去運送水分及養分能力，而HY2001髓部組織發生輕度萎縮，但韌皮部完好（圖8B），說明HY2001能夠更好地抵抗病菌侵襲。

圖8 Y2001和HY2001疫霉菌侵染后表型觀察比較Fig.8 Comparison of phenotype between Y2001 and HY2001 infected by Phytophthora parasitica

對接菌前后抗病相關基因表達水平進行測定發現，在接菌前HY2001的抗病相關基因表達量略高于Y2001，但無顯著差異。接菌后病程相關蛋白基因NtPR1b、細胞凋亡相關蛋白基因Nthsr203J、絲氨酸蛋白酶抑制基因NtNmIMSP、谷胱甘肽S-轉移酶基因NtGST、細胞色素基因NtP450-1與NtP450-2表達水平在HY2001和Y2001中均有提高，但HY2001提高程度高于Y2001，分別是Y2001的1.56、1.28、1.33、2.06、1.75和1.22倍（圖9），除NtP450-2外其他基因在HY2001和Y2001之間的差異均達到顯著水平。說明HY2001對于黑脛病菌的抗性顯著提高。

圖9 Y2001與HY2001抗病相關基因表達量分析Fig.9 Expression levels of disease resistance related genes in Y2001 and HY2001

2.7 蚜蟲抗性分析

取Y2001及HY2001離體葉片進行蚜蟲選擇試驗結果如圖10A和B所示?？梢钥闯鯤Y2001葉片上蚜蟲數量始終顯著低于Y2001，說明HY2001的蚜蟲嗜好性顯著低于Y2001。比較蚜蟲在Y2001及HY2001煙株上的繁殖速率結果如圖10C和圖10D所示。隨著時間的推進，Y2001和HY2001葉片上蚜蟲數量不斷增多，但HY2001上蚜蟲數目始終少于Y2001，接蚜第15天時，Y2001蚜蟲數量達到460頭，與第1天相比，增長23.00倍，而HY2001蚜蟲數量達到275頭，與第1天相比增長13.75倍，增幅明顯小于Y2001。且第15天時Y2001蚜蟲的數量是HY2001的1.67倍，極顯著高于HY2001。表明HY2001株系上蚜蟲繁殖速率顯著低于Y2001。

圖10 Y2001和HY2001的蚜蟲抗性比較Fig.10 Comparison of aphid resistance between Y2001 and HY2001

3 討論

中煙100是豫中濃香型煙葉產區的主栽品種，Y2001是針對葉面非分泌型表皮毛比例偏高、腺毛分泌物含量低的問題選育而來的改良品種，證明了通過腺毛改良能有效提高煙葉的香氣品質。本研究中通過EMS誘變創制了Y2001 NtCycB2基因突變體，并以Y2001為供體親本，通過連續回交、自交及分子標記輔助選擇，結合腺毛表型觀察及分泌物檢測，成功創制出多腺毛Y2001改良株系HY2001，該株系腺毛密度相比中煙100與Y2001顯著提高，西柏烷二萜和蔗糖酯含量也高于中煙100和Y2001，實現了提高Y2001腺毛密度與分泌物含量的目的，且HY2001與Y2001的遺傳背景相似度為97.86%，基本恢復了Y2001的遺傳背景。由于材料創制過程是在實驗室完成的，下一步將在河南濃香型煙葉產區進行多點小區試驗及生產對比試驗，以比較二者的植物學及農藝性狀，從而更好評估HY2001的應用潛力。

有研究表明，腺毛能夠在煙葉表面形成一層空氣薄膜，減弱水分蒸騰［31］，本研究中也發現，HY2001的抗旱性優于Y2001。此外腺毛密度及分泌物的增加也可作為屏障阻止昆蟲在植物表面的移動，從而減少昆蟲對植物體的侵害［32］。同時，腺毛分泌的次生代謝物質，可起到驅趕和毒殺的作用［33］。本研究中室內蚜蟲抗性分析結果表明，HY2001對蚜蟲的吸引力及蚜蟲在HY2001葉片上的繁殖速率均低于Y2001，對蚜蟲的抗性顯著增強，由此推測以蚜蟲為媒介的煙草病毒病發病率將會降低。室內接菌試驗發現HY2001對疫霉菌抗性明顯優于Y2001，其抗病相關基因表達量顯著提升，這些基因在調節植物體內抗病物質的合成、提高防御酶活性、細胞過敏性死亡及抗病信號的傳導等方面起重要作用［34-35］，推測HY2001能更快地合成抗病物質并通過細胞凋亡來阻止疫霉菌絲對煙株的進一步侵染。由于本研究只在盆栽接種條件下調查了HY2001對煙草黑脛病的癥狀表現及抗病相關基因的表達，目前其抗性機理還不清楚，有待進一步深入研究。

4 結論

通過對Y2001 NtCycB2基因進行誘變，創制出多腺毛改良株系HY2001。HY2001株系的煙葉腺毛密度增加，分泌能力旺盛，二萜合成基因表達水平上調，葉面分泌物成分積累量顯著提高。同時煙株抗氧化能力增強，抗病相關基因表達量水平提高，蚜蟲的選擇嗜好性及繁殖率降低，對干旱、黑脛病以及蚜蟲的抗性顯著提高。因此，HY2001株系在豫中濃香型煙葉產區具有較大的應用潛力。