外施α-酮戊二酸對鹽脅迫下海濱錦葵生長、碳氮磷養分積累及其計量關系的影響

吳雨露， 扈嘉鑫， 陳宇熙， 鄭炳松， 閆道良

（浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300）

土壤鹽漬化已成為制約植物生長發育及產量的主要環境問題，研究植物對鹽漬化土壤的適應機制并建立相應的抗鹽調控技術對植物的生產至關重要。在諸多的抗鹽調控技術中，化學調控因其方式的可調控性和技術的綜合性而備受關注[1]。α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，KG）作為有機碳源物質，能夠被植物直接吸收而進入三羧酸循環，在氮代謝中起著重要的作用。α-酮戊二酸是植物氨同化必需的碳架及信號分子，廣泛參與了植物碳（C）、氮（N）代謝的調節，是協調碳、氮兩大代謝系統的關鍵調節物質[2]。研究表明，外源施用α-酮戊二酸可以明顯提高水稻體內氨同化酶的活性，同時銨吸收與同化能力也明顯加強，對植物氮代謝有明顯的調節作用，并增強其對鹽漬逆境的適應[3?4]。黃楠等[5]、吳婷婷等[6]的研究表明，外施一定水平的α-酮戊二酸可以顯著提高鐵皮石斛的產量和品質。

海濱錦葵（Kosteletzkya virginica）是一種集油料、造紙、藥用、觀賞與改良鹽堿地生態環境為一體的重要經濟耐鹽植物[7]，目前對海濱錦葵的研究主要集中在抗鹽生理及分子機制等方面[8-10]，關于海濱錦葵栽培調控的生理鮮有報道。α-酮戊二酸作為有機碳肥，能夠調節因植物“碳饑餓”導致C、N、磷（P）間的化學計量失衡，從而提高作物產量、品質及抗逆性。本課題組前期研究表明，氮虧缺是影響沿海灘涂海濱錦葵生長發育的重要限制因子[11]。為此，本研究以海濱錦葵幼苗為材料，通過模擬鹽脅迫下施用有機碳肥α-酮戊二酸對海濱錦葵生長及對C、N、P 養分吸收及其之間化學計量平衡關系的影響，以期為將來利用α-酮戊二酸調控鹽堿地植物的生長及其對C、N、P 養分的吸收利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用海濱錦葵種子購自江蘇鹽城鹽土農業公司。供試塑料缽，規格為12 cm（直徑）×11 cm（高），購自浙江卡爾生物技術有限公司。供試基質河沙均為洗凈無雜質河沙。試劑α-酮戊二酸(99.9%)購自上海阿拉丁試劑有限公司，分析純；氯化鈉（NaCl）購自浙江卡爾生物技術有限公司，主要成分為99.9%的NaCl，分析純。所用營養液采用Hoagland 配方，配制所需對照及NaCl溶液。

1.2 試驗設計

選取當年收獲、籽粒飽滿完好的海濱錦葵種子，表面消毒后溫室催芽，挑選萌發一致的種子播種于塑料缽內，缽內基質為洗凈的河沙。出苗后每缽保留長勢一致幼苗5~7 株，待幼苗有3~4 片真葉完全展開后，分別用0、5、15 g·L-1NaCl 溶液和0、10、20 mg?L-1α-酮戊二酸處理，共設置9 組處理，具體信息詳見表1。試驗中每隔3 d 澆灌NaCl 溶液，直至其剛好從缽底流出，以盡可能減少鹽在基質中的積累，保證基質中鹽水平恒定；在鹽處理后的第2天，噴施α-酮戊二酸，使葉面完全濕潤。每個處理5 個重復（5 個營養缽），共45 缽。所有處理的植物材料置于人工氣候箱內，箱內晝/夜溫度為（27±1）℃/（22±1）℃，相對濕度為60%~70%。處理45 d后，采樣測定并分析。

表1 試驗組設置情況Table 1 Setting of experimental group

1.3 指標測定方法

收獲的海濱錦葵根部泥沙用流動自來水小心洗凈，再用蒸餾水沖洗2遍后于120 ℃烘箱中殺青20 min，轉至80 ℃烘干至恒重。用直尺測定株高(cm)，用千分之一電子秤稱量植株生物量(干重,mg)。根冠比、相對生長率（%）、比葉重采用下面公式計算。用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定植物全碳含量[12]；采用硫酸-雙氧水消解，凱氏法測定植物中總氮含量；ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry)分析儀測定植物磷、鉀、鈉元素含量[13]，計量單位為g·kg-1DW。

1.4 數據處理

用SPSS 13.0 對數據進行統計分析，處理間差異顯著性(P<0.05)采用Duncan 多重比較。指標間相關性采用Pearson 分析。所有數據均是各處理平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 α-酮戊二酸處理對鹽脅迫條件下海濱錦葵生長的影響

由表2可見，與對照相比，NaCl處理會顯著抑制海濱錦葵植株生長，其株高和植株相對生長率均顯著降低(P<0.05)。其中，15 mg?L-1NaCl 處理的株高僅為對照的42.82%。另外，施加α-酮戊二酸后并沒有明顯改善單鹽脅迫下海濱錦葵的株高和相對生長率。

表2 不同α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵株高Table 2 Plant height of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate

2.2 α-酮戊二酸處理對鹽脅迫條件下海濱錦葵生物量積累的影響

由表3可知，與對照相比，單施α-酮戊二酸顯著提高了海濱錦葵的生物量，NaCl 鹽脅迫則顯著降低了其生物量（S5 處理除外）。鹽脅迫下，外施α-酮戊二酸增加了海濱錦葵的總生物量，但并沒有明顯緩解鹽對海濱錦葵生物量積累的抑制效應。在NaCl 濃度為15 g?L-1處理下，外源噴施20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著提高了海濱錦葵的根生物量，是15 g?L-1NaCl 脅迫下的1.4 倍，說明α-酮戊二酸促進了高鹽脅迫下海濱錦葵根生物量的積累，這與該條件下海濱錦葵具有較高的根冠比相一致。同時，研究發現外施20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著增加了5 g?L-1NaCl 脅迫下的海濱錦葵葉生物量，說明噴施適宜水平的α-酮戊二酸有利于減緩鹽脅迫對植株葉生物量積累的抑制，這對植株碳同化正常功能的發揮有著重要的作用。

表3 鹽脅迫條件下不同α-酮戊二酸處理的海濱錦葵單株生物量、根冠比和比葉重Table 3 Biomass per plant， root shoot ratio and specific leaf weight of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

比葉重是反映植物光合能力的重要指標。與對照相比，鹽脅迫顯著增加了海濱錦葵的比葉重，外施α-酮戊二酸后明顯提高了鹽脅迫下的比葉重，說明海濱錦葵對鹽有一定的適應性，外施α-酮戊二酸對提高葉的光合性能有重要的作用。

2.3 α-酮戊二酸處理對鹽脅迫條件下海濱錦葵C、N、P化學計量特征的影響

植物對營養元素的吸收與環境中養分的供應有密切的關系，在養分供應缺乏的情況下往往具有較高的養分利用效率。由表4 可見，與對照相比，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著提高了植株的總C 含量，是對照的1.07 倍。在15 g?L-1NaCl 高鹽脅迫下，外施α-酮戊二酸對海濱錦葵總C 的積累具有顯著效果，是該鹽梯度（S15 處理）脅迫下的1.1 倍。外施α-酮戊二酸對海濱錦葵總N 含量有明顯的影響，即增加了植株的總N含量，尤其是20 mg?L-1α-酮戊二酸施加后，植株的總N含量顯著高于對照，是對照的1.04 倍；另外，外施10 mg?L-1α-酮戊二酸僅明顯提高了5 g?L-1NaCl 低鹽脅迫下海濱錦葵葉片的N 與P 含量。以上結果表明α-酮戊二酸對鹽脅迫下海濱錦葵葉片N、P含量的影響受到用量的影響。15 g?L-1NaCl 脅迫下，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸可以顯著提高海濱錦葵的C/N 和C/P，說明高鹽脅迫下施加適當水平的α-酮戊二酸能顯著提高海濱錦葵對N、P的利用效率，產出更多的碳水化合物。10、20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著提高了15 g?L-1NaCl脅迫下海濱錦葵的N/P，與僅施加15 g?L-1NaCl 脅迫相比，差異明顯(P<0.05)，說明α-酮戊二酸促進了高鹽脅迫下海濱錦葵對磷的利用效率。

表4 鹽脅迫下不同α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵葉片碳、氮、磷化學計量特征Table 4 Stoichiometric characteristics of carbon， nitrogen and phosphorus in leaves of K. virginica plants treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

2.4 α-酮戊二酸處理對鹽脅迫條件下海濱錦葵Na+、K+含量的影響

由表5可見，外施α-酮戊二酸不同程度地提高了海濱錦葵葉片中的K+含量，其中，施加10 mg?L-1α-酮戊二酸顯著增加了葉片K+含量，是對照處理的1.23倍。在5 g·L-1NaCl處理下，施加10 mg?L-1α-酮戊二酸顯著增加了葉片的K+含量，說明α-酮戊二酸可以促進鹽脅迫下葉片對K+的吸收。但是，只噴施α-酮戊二酸并沒有顯著影響葉片中Na+的含量；在5 g·L-1NaCl 低鹽脅迫下，施加20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著降低了該鹽度脅迫下的Na+含量。對K+/Na+而言，只噴施α-酮戊二酸能顯著增加其比值，在鹽脅迫下施加α-酮戊二酸并沒有顯著影響K+/Na+比值。在鹽環境下，植物體內維持相對較高且穩定的K+/Na+是保證植物正常酶活性的必要條件，本試驗中，α-酮戊二酸對于鹽脅迫的海濱錦葵沒有通過促進K+/Na+值來提高植株對鹽脅迫的適應，這可能與海濱錦葵本身對一定含量的鹽具有較強的適應性有關。

表5 鹽脅迫下α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵葉片Na+、K+含量及其化學計量特征Table 5 Na+， K+ contents and their stoichiometric characteristics in leaves of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

2.5 α-酮戊二酸處理對鹽脅迫條件下海濱錦葵各指標間的相關性分析

葉片是植物進行光合作用的主要功能器官。在鹽脅迫下，植物體內的Na+、K+含量與C、N、P養分含量及其化學計量間的平衡對海濱錦葵的正常生長發育極其重要。相關性分析（表6）發現，海濱錦葵葉片總N 與總P 呈極顯著正相關(P<0.01)，與葉片N/P呈極顯著負相關(P<0.01)，而與葉K+/Na+呈極顯著正相關(P<0.01)；海濱錦葵葉片總P含量與Na+含量呈極顯著負相關，與葉K+含量呈極顯著正相關。葉片中N/P與K+/Na+呈極顯著負相關，說明在α-酮戊二酸處理下，葉片總N、總P的積累和平衡與環境中Na+對鹽生植物海濱錦葵生長有協同作用。

表6 鹽脅迫下不同α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵葉N、P、Na+、K+化學計量特征相關性分析Table 6 Correlation analysis of stoichiometric characteristics of N， P， Na+， K+ in leaves of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

3 討論

α-酮戊二酸是植物三羧酸循環中重要的代謝中間產物，是連接細胞內碳-氮代謝的關鍵節點，參與細胞內多種化學反應，具有多種生理功能。對釀酒酵母的培養發現，添加一定水平的α-酮戊二酸后，細胞的代謝活性增強，總抗氧化能力和氨基酸含量等指標也得以提高[14]。對其他植物的研究也表明，外施α-酮戊二酸可以明顯提高植物體內氨同化酶的活性，同時銨吸收與同化能力也得到明顯加強，對植物氮代謝有明顯的調節作用[15?16]。同樣，外施一定水平的α-酮戊二酸對逆境下植物的生長具有重要的正向調節作用。外施α-酮戊二酸增強了干旱脅迫下小麥氮代謝強度，減緩了干旱脅迫對小麥產量降低的影響，增強其對干旱逆境的適應[17?18]。另外，外施α-酮戊二酸改善了小麥低氮脅迫下植株的生長，促進了逆境下小麥的氮代謝，提升了小麥的產量[19]。本研究表明，在鹽脅迫下外施α-酮戊二酸雖然增加了海濱錦葵的總生物量，但并沒有明顯緩解鹽對海濱錦葵生物量積累的抑制效應，這可能與不同物種的生物學特性有關。在15 g?L-1鹽處理下，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸則明顯提高了海濱錦葵的根生物量，說明α-酮戊二酸有利于海濱錦葵把更多碳物質向根轉移，作為后備能源物質儲存起來，以更好地維持鹽漬環境下生命的延續，研究結果為α-酮戊二酸提高鹽脅迫環境下海濱錦葵的適應性機制提供了參考。

鹽脅迫是影響植物生長的重要環境因素，植物通過積累更多的K+，以減輕Na+對植物的離子毒害[20?21]。本研究表明，外施α-酮戊二酸顯著提高了低鹽脅迫下（5 g·L-1NaCl）葉片的K+含量，但對K+/Na+的影響并不明顯，這可能與海濱錦葵具有一定的喜鹽性有關。同時，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸分別顯著增加了低鹽和高鹽脅迫下海濱錦葵的比葉重，說明外施α-酮戊二酸有利于緩解鹽脅迫對葉片光合性能的抑制作用，從而有利于碳物質合成和積累。C/N 和C/P 反映了植物對N、P的利用效率，效率越高，碳物質的積累越多。本研究表明，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸可以顯著提高高鹽脅迫下（15 g·L-1NaCl）海濱錦葵的C/N 和C/P，說明高鹽脅迫下施加適量的α-酮戊二酸能明顯提高海濱錦葵對N、P 的利用效率，增加了碳物質的合成和積累，從而促進了植株生物量的提高。

近年有研究表明，外施α-酮戊二酸不但可以提高動物體內蛋白質的沉積和免疫能力[22]，而且α-酮戊二酸作為有機碳肥的研究與實踐利用也取得了一定的成果，它不但可以緩解逆境對植物生長的抑制作用，而且在增產和提高植物品質方面也得到了證實[23-25]。本研究發現，噴施α-酮戊二酸后，海濱錦葵葉片總N 含量與K+/Na+呈現極顯著正相關，說明噴施α-酮戊二酸后在促進N 含量的同時，K+/Na+值也得到了提高，從而有利于維持鹽脅迫下葉片K+的平衡，緩解Na+對細胞的毒害作用。同時，N 與P 含量呈極顯著正相關，施加α-酮戊二酸后，在提高N含量的同時，也促進了海濱錦葵對P的吸收利用，而植株吸收、積累一定量的P，有利于提高植株對逆境的適應。

綜上所述，外源噴施α-酮戊二酸促進了海濱錦葵植株的生物量積累。在低鹽（5 g·L-1NaCl）脅迫下，外施α-酮戊二酸顯著提高了植株的K+含量，增加了K+/Na+。其中，施加20 mg?L-1α-酮戊二酸可以顯著增加鹽脅迫下海濱錦葵的比葉重，說明α-酮戊二酸對鹽脅迫下海濱錦葵的光合性能有較好地促進作用。同時，α-酮戊二酸提高了葉片對N、P的利用效率，增強了碳物質的合成。