響應面法優化禾谷鐮刀菌產脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物的液體培養條件

趙秀英， 黃晴雯， 曹浩杰， 王杰， 李瑞姣，聶冬霞， 韓錚， 趙志輝*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海市農業科學院，農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，主要是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）產生的次級有毒代謝產物[1?2]。DON 具有細胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性等多種毒性，是世界各地谷類作物的常見污染物[3-5]，已被聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界衛生組織（World Health Organization，WHO）確定為較危險的自然發生食品污染物之一[6-8]。鑒于其較高的毒性和普遍污染的特性，世界各國組織都規定了谷物和谷物制品中DON 的最大容許限度，歐洲共同體委員會（European Community ，EC）確定了未加工谷物（硬粒小麥、燕麥和玉米除外）中DON 的限量為1 250 μg·kg?1，未加工的硬粒小麥和燕麥為1 750 μg·kg?1[9]。我國規定小麥、面粉、玉米和玉米粉等谷物及其制品中DON 含量均不得高于1 000 μg·kg?1[10]。

鐮刀菌在適宜條件下不僅會產生原型DON，也會生成其乙?；苌?，DON 的乙?；饕l生在3’和15’位點，分別為3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）和15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?5-acetyldeoxyniva?lenol，15-ADON）。不同種的鐮刀菌菌株可以產生不同化學型的真菌毒素。例如，禾谷鐮刀菌可同時產生DON 和15-ADON 或者DON 和3-ADON，并且它們的分布隨地理位置和采樣年份會發生變化[11?12]。DON 及其衍生物在小麥等谷物中普遍存在，繼而對人類和動物的安全造成嚴重威脅，因此，需重視DON 乙?；a物的相關研究。乙?；疍ON 是DON 生物合成的直接前體，其產生受到菌株自身特性、外界環境（如營養成分、培養條件等）的共同調節。前人關于DON 及其衍生物發生規律的研究主要集中于小麥、玉米、大米等固體培養基中[13-15]。但是，固體培養基中的主要影響因素和條件如培養基的成分、初始pH、菌絲量等難以控制和測量，因此難以精確分析各因素對菌株生長和毒素產生的影響。液體發酵可以精確調控相關影響因素，并且獲得大量菌絲體或代謝產物，且培養周期短，更易于擴大培養[16?17]。因此，研究液體基質中DON 原型和乙?；疍ON 的產生規律具有重要意義，可更好地確定產毒的最佳營養和環境參數。

本研究采用液體培養法對禾谷鐮刀菌的產毒條件進行優化，通過響應面法分析不同培養基組成（碳源、氮源等的含量）和不同培養條件（培養時間、培養溫度、初始pH 等）對DON 及其乙?；苌锂a生的影響，欲明確禾谷鐮刀菌產毒的主要影響因素，為農產品中DON 及其衍生物的污染防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗試劑：甲醇、乙腈（色譜純）購于美國Merck公司；乙酸銨購于美國CNW公司；葡萄糖、乙酸鈉、硝酸鉀（KNO3）、磷酸二氫銨（NH4H2PO4）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、七水合硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）（分析純）購于上海源葉生物科技有限公司；DON、3-ADON、15-ADON標準品購于青島普瑞邦生物工程有限公司；PDA培養基購于北京沃凱生物科技有限公司；Milli-Q超純水購于美國Millipore公司。

試驗儀器：Heraguard ECO 超凈臺（美國Thermo Fisher 公司）、MJ-300 霉菌培養箱（上海般諾生物科技有限公司）、CL-40L 高壓滅菌鍋（日本ALP 公司）、ST16R 冷凍離心機(美國Thermo Scientific 公司）、HSC-24B 氮吹儀（上海楚定分析儀器有限公司）、TH-2500 超聲波清洗儀（上海安譜試驗科技股份有限公司）、ST3100 pH 計（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）和TRIPLE QUADTM 5500 三重四級桿質譜儀（美國AB SCIEX公司）。

禾谷鐮刀菌株1096 由上海市農業科學院農產品質量標準與檢驗技術研究所真菌毒素研究室提供，購自德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株的活化 將禾谷鐮刀菌菌株1096 接種在PDA 平板培養基中央，置于28 ℃培養箱內，黑暗條件下培養5 d，用于后續接種。

1.2.2菌株的液體培養 在超凈工作臺內用直徑為1 cm的打孔器取1個活化菌種的外圈菌餅，接種到滅菌后的液體培養基內，用無菌封口膜包扎好后放入恒溫培養箱內靜置培養。培養結束后過濾分離菌絲和濾液，菌絲于60 ℃干燥，稱重。

1.2.3液體培養基配方優化 固定無機鹽成分和比例（KCl 2 g·L?1，KH2PO40.5 g·L?1，MgSO4·7H2O 0.7 g·L?1，FeSO4·7H2O 15 mg·L?1，ZnSO4·7H2O 20 mg·L?1），以培養基成分中的葡萄糖、乙酸鈉、KNO3、NH4H2PO4的質量濃度為單因素自變量[18?19]，考察葡萄糖質量濃度分別為10、20、30、40、50 g·L?1，乙酸鈉質量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g·L?1，KNO3質量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g·L?1，NH4H2PO4質量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g·L?1時對毒素含量及菌絲量的影響，28 ℃黑暗培養2周，每組3個平行，優化最佳的培養基成分配比。

1.2.4培養條件優化 以培養時間、培養溫度、初始pH為單因素自變量[20-22]，固定培養基初始pH為6，培養溫度為28 ℃，考察培養時間分別為5、10、15、20、25 d 時對毒素含量及菌絲量的影響；固定培養基初始pH為6，培養時間15 d，培養溫度分別為15、20、25、28、31 ℃時對毒素含量及菌絲量的影響；固定培養時間為15 d，培養溫度為28 ℃，初始pH 分別為4、5、6、7、8 時對毒素含量及菌絲量的影響，每組試驗重復3次。

1.2.5響應面法確定最佳培養條件 綜合以上培養條件單因素試驗結果，選取合適的單因素范圍，以毒素的產出量為響應值，根據Box-Behnken 原理設計響應面曲面分析試驗，確定最佳培養條件。使用Design Expert 8.0.6 進行試驗設計和數據分析，試驗因素和水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface experiment factors and levels

1.2.6樣品處理及分析 樣品處理：培養結束后，精確吸取5 mL 濾液于50 mL 離心管中，加入20 mL乙腈，超聲提取30 min后，4 500 r·min?1離心10 min，取5 mL 上清液氮吹至近干，采用1 mL 的5 mmol·L?1乙酸銨水溶液/甲醇（體積分數50/50）溶解殘渣，充分溶解后，適量稀釋，過0.22 μm 濾膜，采用超高效液相色譜串聯質譜（ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）測定含量。

液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：流動相A為甲醇，流動相B 為5 mmol·L?1乙酸銨水溶液；梯度洗脫程序：0—1 min，10% A；1—8 min，10 % A~30% A；8—9 min，30% A~90% A；9—9.1 min，90% A~10% A；9.1—11 min，90% A~10% A；流速0.3 mL·min?1；進樣量3 μL；柱溫40 ℃。

質譜條件：離子化模式為電噴霧電離源（electrospray ionization source, ESI）；質譜掃描模式為多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式；離子源溫度500.0 ℃；噴霧電壓5 500 V；霧化氣50 Psi；輔助氣50 Psi；碰撞氣8 Psi；噴霧電壓氣簾氣35 Psi。DON、3-ADON 和15-ADON 的母離子、子離子和碰撞電壓等質譜參數見表2。

表2 DON、3-ADON和15-ADON的質譜參數Table 2 MS/MS parameters for DON， 3-ADON and 15-ADON

通過測定線性、靈敏度、回收率和精密度驗證分析方法。DON、3-ADON 和15-ADON 在各自濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.999。以定性離子通道信噪比（signal to noise，S/N）為3 時的樣品質量濃度為目標毒素的檢出限（limit of detection，LOD）；定量離子通道信噪比為10 時的樣品質量濃度為目標毒素的定量限（limit of quantitation，LOQ）；測定分析方法的靈敏度。DON的LOD為1 μg·L?1，LOQ為2 μg·L?1；3-ADON和15-ADON 的LOD 均為0.5 μg·L?1，LOQ 均為1 μg·L?1。將3種毒素按低、中、高3個水平（5、50、100 μg·L?1）進行空白基質加標，經處理后上機測定3 種毒素的實際質量濃度，將實際質量濃度與理論值的百分比計為回收率，以1 d 內測定3 次和連續3 天測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別作為日內精密度和日間精密度。DON 的加標回收率范圍為81.03%~103.97%，3-ADON 的加標回收率范圍為80.18%~86.06%，15-ADON 的加標回收率范圍為81.34%~90.72%；該方法的精密度（RSD）范圍在2.80%~11.98%之間（表3）。

表3 液體培養基中DON、3-ADON和15-ADON的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of DON， 3-ADON， and 15-ADON in liquid culture （n=3）

1.3 數據分析

使用Origin Pro 2019 作圖，使用Design-Expert 8.0.6進行響應面試驗設計及分析。

2 結果與分析

2.1 液體培養基配方優化結果分析

2.1.1葡萄糖添加量的影響 受試鐮刀菌株在液體培養中的主要產物是DON 和15-ADON，幾乎無3-ADON，標準品和培養物MRM 圖譜如圖1 所示。隨著葡萄糖添加量的增加，菌絲量和毒素含量都隨之增加，當葡萄糖增加到40 g·L?1時，DON 和15-ADON 的產量增加趨勢趨于平緩（圖2A）。葡萄糖是一種速效碳源，有助于菌體的生長繁殖，且隨著葡萄糖含量的增多，毒素產量也逐漸增高。

圖1 標準溶液與培養物樣品溶液的TIC圖譜Fig. 1 TIC chromatograms of the standard solution and the sample

圖2 不同培養基條件下菌株的生長及DON和15-ADON產量Fig. 2 Growth of strains and production of DON and 15-ADON under different culture mediums

2.1.2乙酸鈉添加量的影響 乙酸鈉作為大多數真菌毒素的合成前體，其添加量對DON和15-ADON的產量具有較大影響（圖2B）。一定范圍內隨著乙酸鹽添加量的增加，DON 和15-ADON 產量也逐漸增多，其中當乙酸鈉為1.5 g·L?1時，DON 產量最高；當其添加量為1 g·L?1時，15-ADON 產量最高。繼續增加乙酸鹽，DON 及15-ADON 的產量均逐漸降低，但菌絲量隨著乙酸鈉添加量的增加呈持續增加趨勢。

2.1.3KNO3添加量的影響 從圖2C 可以看出，隨著硝酸鹽添加量的增大，菌絲量平緩增加，但DON 和15-ADON 的產量呈現下降趨勢，其中不添加硝酸鹽的毒素產量最高。

2.1.4NH4H2PO4添加量的影響 隨著NH4H2PO4添加量的增加，DON 和15-ADON 的產量呈現先增加后降低的現象（圖2D）。當銨鹽為1 g·L?1時，毒素產量最高；添加銨鹽也會影響菌絲的生長，但影響較小。綜合單因素試驗結果，得出受試菌株產DON的各營養元素的最佳質量濃度為：葡萄糖50 g·L?1，乙酸鈉1.5 g·L?1，NH4H2PO41 g·L?1；產15-ADON 的最佳質量濃度為：葡萄糖50 g·L?1，乙酸鈉1.0 g·L?1，NH4H2PO41 g·L?1。

2.2 培養條件優化結果分析

2.2.1初始pH 的影響 pH 是影響菌株生長和代謝的重要因素，受試菌株在不同酸堿環境下的生長和產毒情況如圖3A 所示，菌絲量隨著初始pH的升高而增加，說明堿性條件更利于菌株生長；DON 和15-ADON 的產量均隨著pH 的升高先增加后降低，其中最佳產毒初始pH為5。

2.2.2培養溫度的影響 適宜的培養溫度是真菌生長繁殖及代謝產毒的必要條件，溫度過高或過低均會抑制真菌生長代謝，導致菌株產毒能力下降甚至不產毒。由圖3B可知，菌體的最適生長溫度和最佳產毒溫度不一致，其中受試菌株的最適生長溫度為25 ℃；最佳產毒溫度為28 ℃。

A：初始pH；B：培養溫度；C：培養時間A： Initial pH； B： Incubation temperature； C： Incubation time

2.2.3培養時間的影響 隨著培養時間的延長，菌絲量不斷增多，DON 產量在培養第20天達到最大，此后產量相對于菌絲量不斷減少，而15-ADON 的產量在培養第15 天達到最高，此后產量不斷降低（圖3C）。

2.3 響應面法優化液體培養條件

2.3.1DON 響應面試驗結果分析 根據單因素試驗結果，選擇培養時間（A）、培養溫度（B）和培養初始pH（C）作為自變量，以DON的產量（Y）為響應值，進行3因素3水平的Box-Behnken響應面優化試驗。使用Design-Expert 8.0.6 軟件對表4 的試驗結果進行多元回歸擬合分析，擬合方程為如下。

表4 DON 響應面試驗結果Table 4 Results for response surface experiments of DON

該回歸模型的相關系數R2為0.979 4，調整R2為0.952 9，表明此回歸模型可以解釋95.29% 響應值的變化。整體模型達到顯著水平（P<0.000 1），失擬項不顯著（P=0.846 6），表明該模型的擬合度較好，準確度高，試驗誤差小。因此可以用該模型對影響DON產量的培養條件進行預測和分析。方差分析結果表明，A、C、A2、B2、C2對DON的產量影響極顯著（P<0.01），B、AC對DON的產量影響顯著，其他均不顯著（P>0.05）(表5)。

表5 DON響應面模型方差分析Table 5 Analysis of variance for quadratic regression equation of DON

通過Design-Expert 8.0 6軟件對各因素及因素間的交互作用進行分析，得到相應的響應面和等高線圖（圖4）。培養時間的變化曲面弧度較培養溫度的變化趨勢更陡，說明培養時間對DON 產量的影響較培養溫度更顯著；培養基初始pH的變化曲面弧度較培養溫度的變化趨勢更陡，說明培養基初始pH對DON產量的影響較培養溫度更顯著。在因素間交互項作用對DON 產量的影響中，培養時間與初始pH 的等高線圖呈橢圓形，說明2 因素間交互作用顯著影響DON 產量，且該結果與影響DON產量的各因素顯著性分析結果（表5）一致。

圖4 培養時間、培養溫度和初始pH交互結果對DON的產量的響應面及等高線圖Fig. 4 Response surface and contour map of the interactive effects of incubation time， incubation temperature and initial pH value on the production of DON

通過模型得出液體培養產DON 的最佳條件為：培養時間21.79 d，培養溫度26.26 ℃，初始pH 6.35；在此培養條件下，理論預測的DON 產量為5 860.35 μg·L?1?？紤]到實際的可操作性，將液體培養產DON 的最佳條件矯正為：培養時間22 d，培養溫度26.3 ℃，初始pH 6.35，實際培養后DON 的產量為5 739.69 μg·L?1，與理論預測值的相對誤差為2.1%。

2.3.215-ADON 響應面試驗結果分析 根據單因素試驗確定的因素及范圍，選擇培養時間（A）、培養溫度（B）和初始pH（C）作為自變量，以15-ADON 的產量（Y）為響應值，進行3 因素3 水平的Box-Behnken 響應面優化試驗，結果如表6 所示。使用Design-Expert 8.0.6 軟件進行多元回歸擬合分析，15-ADON的擬合方程如下。

表6 15-ADON響應面試驗結果Table 6 Results for response surface experiments of 15-ADON

模型的相關系數R2為0.970 5，調整R2為0.932 5，表明自變量選擇合適，模型能較好的描述試驗結果。整體模型達到顯著水平（P<0.01），失擬項不顯著（P=0.748 7），表明該模型的擬合度較好，準確度高。方差分析結果（表7）表明，A、A2、B2、C2對15-ADON 產量影響極顯著（P<0.01），B、C、AB對15-ADON 產量影響顯著（P<0.05），其他不顯著。

表7 15-ADON響應面模型方差分析Table 7 Analysis of variance for quadratic regression equation of 15-ADON

通過Design-Expert 8.0 6 軟件對影響15-ADON 產量的各因素及因素間的交互作用進行分析，得到不同因素交互作用的響應面圖及等高線圖（圖5）。培養時間和培養溫度間形成了較明顯的曲面，說明15-ADON 的產量對培養時間和培養溫度敏感；等高線呈橢圓形，表明2 因素間交互作用對15-ADON 產量影響顯著；培養時間的變化曲面弧度較培養溫度更為陡峭，說明培養時間對15-ADON 產量的影響較培養溫度更顯著。培養時間變化曲面弧度較初始pH更陡峭，說明培養時間對15-ADON 產量的影響較初始pH 更顯著。溫度與初始pH 的等高線圖中2 因素形成的曲線斜率相近，表明交互作用較弱。以上結果與各影響因素對15-ADON 產量影響的顯著程度分析結果（表7）一致。

圖5 培養時間、培養溫度和初始pH交互結果對15-ADON的產量的響應面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour map of the interactive effect of incubation time， incubation temperature and initial pH value on the yield of 15-ADON

通過模型得出液體培養產15-ADON 的最佳條件為：培養時間21 d，培養溫度25.26 ℃，初始pH 5.58，在此培養條件下，理論預測的15-ADON產量為10 163.8 μg·L?1?？紤]到實際的可操作性，將最佳培養條件調整為：培養時間21 d，培養溫度26.3 ℃，初始pH 5.58，此條件實際培養后15-ADON 的產量為10 453.41 μg·L?1，與理論預測值的相對誤差為2.80%。

3 討論

真菌代謝產物的生成效率與菌株自身特性有關，同時也受到培養條件的影響，因此培養基的營養成分及培養條件對禾谷鐮刀菌產毒是非常重要的。

在培養基的營養成分中，對菌體生長和代謝影響最大是碳源和氮源的組成和比例。本研究使用葡萄糖作為碳源，研究其不同質量濃度對受試菌株生長和代謝的影響。葡萄糖是速效碳源，有助于菌體的生長繁殖，且隨著葡萄糖添加量的增加，菌株的毒素產量增多，與甄玉萍等[23]的研究結果一致。乙酸鹽是很多真菌代謝產物的合成前體，其添加量對DON和15-ADON的產量有顯著影響。本研究結果表明，添加乙酸鹽會影響毒素的產率，但具體是因為乙酸鹽的直接作用還是因為添加乙酸鹽導致pH變化的影響，還需要做進一步研究。氮素是微生物生長必不可少的營養元素，Gardiner 等[24]研究表明，硝酸鹽的存在會抑制DON 的合成，而銨鹽能刺激DON 的合成，與本研究結果一致。

培養條件（時間、溫度和初始pH）對菌株產毒的影響較大，低初始pH 雖然能誘導DON 及乙?；疍ON 的積累，但不適合真菌的生長發育[25]。本研究表明，受試菌株最佳產毒的初始pH 為5；環境溫度過高或過低都可能導致代謝通路的改變、酶活力的喪失，從而影響關鍵基因的表達[26]，菌體的最適生長溫度和最佳產毒溫度不一致。師雯等[27]報道，禾谷鐮刀菌的最適生長溫度為25 ℃，最佳產毒溫度為30 ℃。本研究中受試菌株的最適生長溫度為25 ℃，最佳產毒溫度為28 ℃，這種差異可能是由菌株和培養基不同造成。本研究表明，隨著培養時間的延長，DON 和15-ADON 的產量均先增加后降低，與徐華等[28]的研究結果一致。培養時間過長造成DON和15-ADON產量下降，推測是由于后期培養基中營養物質消耗殆盡，細菌可能將毒素作為營養物質，將其分解利用，參與其他代謝途徑以保護菌體自身安全[29]，其機理還需要進一步研究證實。

響應面法能夠同時評估多個因素的影響，以及它們之間的相互作用。近年，Wu等[30]采用響應面法評估了初始pH、培養時間和培養溫度對DON和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）產量的影響，表明3個因素對2種毒素的產量均有顯著影響，其影響大小表現為初始pH>培養時間>培養溫度，且3 個影響因素間均存在交互作用。本研究結果證明，培養時間和初始pH 間的交互作用對DON產量影響顯著，其他交互作用不顯著，這種差異可能是由于菌株或培養基的差異造成。對于15-ADON，培養時間和培養溫度間的交互作用對其產量有顯著影響。本研究利用響應面法優化出產DON的最佳培養條件為：培養時間22 d，培養溫度26.3 ℃，初始pH 6.35，此條件培養后DON 產量達5 739.69 μg·L?1；產15-ADON 的最佳培養條件為：培養時間21 d，培養溫度26.3 ℃，初始pH 5.58，此條件培養后的15-ADON 產量達10 453.41 μg·L?1；實際培養結果均與理論預測值相近。

本研究針對目前關于DON 及衍生物的研究聚焦于復雜固體基質，難以測量菌絲生長情況、控制營養成分比例和環境酸堿度等問題，采用液體培養基通過單因素和響應面法系統研究了禾谷鐮刀菌產DON和DON衍生物的主要影響因素，結果表明，培養基的營養成分（碳源和氮源：葡萄糖、乙酸鹽、KNO3、NH4H2PO4）和培養條件（溫度、pH 和培養時間）對禾谷鐮刀菌生長和DON 及其衍生物的產生均有不同程度的影響，且不同因素之間具有顯著的交互作用，研究結果可為DON 類真菌毒素的防控提供理論基礎和數據支持。