過表達(dá)veA基因?qū)谕簧⒛揖渭?jí)代謝的影響

王云勝， 陳銀翠， 程在， 張錦， 張傳博

（貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025）

絲狀真菌次生代謝產(chǎn)物具有極強(qiáng)的活性成分，是天然藥物分子的重要來源之一[1-3]，主要包括聚酮化合物（polyketide，PK）、肽類化合物（non ribosomal peptide，NRP）、PKS-NRPS 雜合類、萜類、生物堿類等[4?5]。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的絲狀真菌基因組被公布，研究者在眾多絲狀真菌基因組中發(fā)現(xiàn)了大量的次生代謝產(chǎn)物表達(dá)基因簇，這些基因常常在染色體上呈線性化排列。然而，絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下表達(dá)量極低或處于沉默狀態(tài)[6?7]，因而，發(fā)現(xiàn)新型結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物相對(duì)較少，仍有大量真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物有待發(fā)現(xiàn)。

veA作為核心基因，參與絲狀真菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控[8]，研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)巢曲霉中柄曲霉素和青霉素合成基因的表達(dá)均受到veA的控制[9]。研究中常采用過表達(dá)或敲除veA來調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的表達(dá)，進(jìn)而激發(fā)真菌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的潛力，在Aspergillus oryzae中過表達(dá)veA，導(dǎo)致抗菌素類次級(jí)代謝產(chǎn)物Penicillin產(chǎn)量的顯著提高[10]；橘青霉中過表達(dá)veA導(dǎo)致降脂類物質(zhì)美伐他汀的產(chǎn)量提高了3倍[11]。

冠突散囊菌是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)益生菌，其豐富的胞外酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)茯磚茶獨(dú)特風(fēng)味和保健功效的形成有著巨大貢獻(xiàn)，具有極大的研究?jī)r(jià)值[12-14]。Ge 等[15]對(duì)冠突散囊菌的基因組測(cè)序分析表明，冠突散囊菌和其他絲狀真菌類似，基因組中有眾多的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，表明冠突散囊菌具有合成次生代謝產(chǎn)物的巨大潛力。然而，關(guān)于冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物合成與調(diào)控的研究較少，嚴(yán)重阻礙了深入挖掘和利用冠突散囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的進(jìn)程[16]。

在冠突散囊菌中，veA被認(rèn)為對(duì)氧化脅迫、性別發(fā)育等生物學(xué)過程有著重要的調(diào)控作用[17]，然而，關(guān)于veA對(duì)冠突散囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控的報(bào)道較少。基于此，本研究使用無縫克隆及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功構(gòu)建了冠突散囊菌veA過表達(dá)突變株，并通過高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)初步研究了veA對(duì)冠突散囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控作用，為深入挖掘和應(yīng)用冠突散囊菌新穎結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物提供新的見解和方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）GZ06 分離于貴州出產(chǎn)的黑茶，保存于貴州師范大學(xué)微生物資源與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Stbl3、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 AGL1 均購(gòu)自武漢源葉生物技術(shù)有限公司。過表達(dá)載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP 購(gòu)自豐暉生物科技有限公司。

1.2 試劑

Eastep?Super總RNA 提取試劑盒購(gòu)自上海普洛麥格生物有限公司；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix、高保真DNA聚合酶購(gòu)自天根生化拜爾有限公司；dNTPs 購(gòu)自Taraka；無縫克隆試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自康潤(rùn)生物有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、BstEⅡ、潮霉素B 溶液、氨芐卡那霉素、DEPC 水、乙酰丁香酮、二甲亞砜、頭孢噻肟鈉、2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸一水等試劑、PCR 引物均由上海生工生物有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)儀器

主要試驗(yàn)儀器包括電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH600 H，天津市泰斯特儀器有限公司）、PCR 擴(kuò)增儀（ETC 811，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、酶標(biāo)儀（EPOCH2，BioTEK）；電泳儀（DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（QuantStudio3，ABI）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1冠突散囊菌分生孢子液的制備 參照Wang 等[18]試驗(yàn)方法，將冠突散囊菌接種在高滲的MYA 培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10 d 后，用無菌水沖洗分生孢子，使用血球計(jì)數(shù)板將冠突散囊菌孢子液濃度稀釋為1×106cell·mL?1備用。

1.4.2veA的擴(kuò)增及過表達(dá)載體的構(gòu)建 將3 mL冠突散囊菌孢子液接種于150 mL PDB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min?1震蕩培養(yǎng)3 d，過濾收集菌絲，參照植物總RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。 獲得總RNA 后，使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，參照無縫克隆試劑盒說明書和已經(jīng)公布的冠突散囊菌veA的序列信息[17]，使用BstEⅡ和BglⅡ限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)載體線性化，并設(shè)計(jì)veAF/veAR引物（表1），以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，片段經(jīng)回收純化后，構(gòu)建gpdA-veA-Trpc 過表達(dá)元件并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Stbl3，載體序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4.3轉(zhuǎn)化 參照劉逸梅[19]的方法將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1。農(nóng)桿菌侵染冠突散囊菌實(shí)驗(yàn)參照朱思遠(yuǎn)等[20]的方法。

1.4.4陽性轉(zhuǎn)化子鑒定 將野生型冠突散囊菌（WT）和過表達(dá)veA突變株（OE::veA1）接種到PDA平板上（含75 μg·mL?1潮霉素），28 ℃培養(yǎng)，觀察能否正常生長(zhǎng)。同時(shí)提取野生型冠突散囊菌和過表達(dá)突變株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后使用RT-qPCR 驗(yàn)證veA相對(duì)表達(dá)量。參照SYBR Green PCR MasterMix 試劑盒說明書，以QveAF/QveAR 為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物（表1），以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內(nèi)參基因[21?22]。在冰上配置體系：cDNA 模板1 μL；QveAF 引物0.5μL，QveAR 引物0.5 μL；2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL；用RNase-Free H2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。使用2-??Ct法[15]計(jì)算基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.5發(fā)酵產(chǎn)物的提取與檢測(cè) 參照杜靜[23]的試驗(yàn)方法，將等量野生型冠突散囊菌和過表達(dá)突變株的分生孢子液接種于大米培養(yǎng)基，28 ℃黑暗培養(yǎng)10 d。發(fā)酵結(jié)束后準(zhǔn)確稱取10 g 發(fā)酵產(chǎn)物，使用醇提法進(jìn)行提取并制備成浸膏。加入10 mL 50%的甲醇溶液充分溶解并過0.22 μm 尼龍濾膜制備成HPLC待測(cè)樣品。檢測(cè)條件參照王琪琪[24]試驗(yàn)方法略有改動(dòng)。色譜條件：Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.5 mL·min?1。流動(dòng)相：純水∶乙腈= 3∶7（體積比）。

1.4.5轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將3 mL 等量的野生型冠突散囊菌（WT）和過表達(dá)突變株的分生孢子液接種于PDB（150 mL）培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)3 d。過濾收集菌絲后，用液氮快速將菌絲體研磨成粉末，使用TRIzol?Reagent kit（Invitrogen)提取總RNA，用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA 的質(zhì)量和含量。利用Oligo (dT)引物和mRNA 的poly A 進(jìn)行互補(bǔ)A-T 配對(duì)，分離總mRNA 后，使用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit 方法構(gòu)建文庫(kù)并完成測(cè)序工作。數(shù)據(jù)下機(jī)后，對(duì)原始序列（raw reads）的進(jìn)行質(zhì)控，然后得到質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（clean reads）。 將得到的clean reads 與冠突曲霉（GCA001717485.1）基因組進(jìn)行比對(duì)組裝。采用表達(dá)定量軟件RSEM 定量分析基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，使用DESeq2 軟件篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選標(biāo)準(zhǔn)：差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C） > 1.5 且P值<0.05。獲得DEGs 后，基于GO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 進(jìn)行注釋，并基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 進(jìn)行通路富集分析。為進(jìn)一步分析過表達(dá)veA對(duì)冠突散囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的影響，使用antiSMASH 在線軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)為編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因進(jìn)行注釋和分析。相關(guān)測(cè)序原始數(shù)據(jù)已提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為PRJNA809521。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2021 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)對(duì)組間差異進(jìn)行顯著性分析。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 veA過表達(dá)突變株的構(gòu)建

以冠突散囊菌cDNA 為模板擴(kuò)增veA的開放式閱讀框，使用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建veA過表達(dá)載體。將測(cè)序正確的veA過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1，經(jīng)潮霉素抗性PDA 平板和veA的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)（圖1）表明，過表達(dá)突變株（OE::veA1）在潮霉素抗性PDA 平板上能正常生長(zhǎng)，且veA的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于野生型，由此表明，過表達(dá)突變株構(gòu)建成功。

圖1 veA過表達(dá)突變株的鑒定Fig. 1 Screening of veA overexpression mutant

2.2 高效液相色譜分析代謝成分差異

野生型冠突散囊菌（WT）和過表達(dá)突變株（OE::veA1）的高效液相色譜圖譜具有較大差異（圖2）。相較于WT，OE::veA1 中物質(zhì)吸收峰1 的相對(duì)峰面積提高了4.09 倍。且物質(zhì)吸收峰2、3 和4 在野生型冠突散囊菌中未檢測(cè)到。由此說明，過表達(dá)veA基因可能激活了冠突散囊菌中某些次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，產(chǎn)生了新的次級(jí)代謝化合物。

圖2 野生型冠突散囊菌和OE：：veA1發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig. 2 HPLC chromatograms of fermentative products of wildtype E. cristatus and OE：：veA1 mutant

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

對(duì)野生型（CK）和過表達(dá)veA突變株（OE::veA1）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads） 337 234 764 條；質(zhì)控后，獲得clean reads 共334 959 602 條；各樣本錯(cuò)配率均低于0.05%（表2），說明測(cè)序結(jié)果良好。此外，序列質(zhì)控參數(shù)Q20和Q30均達(dá)95%以上，說明測(cè)序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Transcriptome sequencing data statistics

2.4 差異表達(dá)基因分析

2.4.1差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì) 以TPM 為表達(dá)量指標(biāo)，使用DESeq2 軟件篩選DEGs。在WT 和OE::veA1 組中共篩選出737 個(gè)DEGs，其中，282 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)；455個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)（圖3）。

圖3 野生型與過表達(dá)突變株的差異表達(dá)基因Fig. 3 Differentially expressed genes between WT and OE：：veA1

2.4.2DEGs 的GO 注釋 進(jìn)一步使用GO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 進(jìn)行注釋，結(jié)果（圖4）表明，GO 功能注釋主要包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類。其中，在生物過程大類中，DEGs 主要涉及細(xì)胞過程（24.29%）、代謝過程（22.25%）、定位（9.91%）和生物調(diào)控（8.41%）；在細(xì)胞組分大類中，DEGs 主要涉及膜部分（30.39%）、細(xì)胞部分（20.08%）和細(xì)胞器（10.31%）；在分子功能大類中，主要涉及催化活性（44.23%）和結(jié)合（39.76%）。

圖4 DEGs的GO注釋分類Fig. 4 GO annotation classification of DEGs

2.4.3差異基因KEGG 富集分析 使用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 進(jìn)行通路富集分析（圖5），結(jié)果表明，氮代謝、MAPK 信號(hào)途徑、多種氨基酸代謝及乙醛酸和二羧酸代謝等通路均有富集。其中，萜類化合物合成骨架通路中有4 個(gè)基因（SI65_09721、SI65_05138、SI65_07629 和SI65_08119）被富集且均顯著上調(diào)表達(dá)，分別被注釋為聚戊烯基合成酶、異戊二烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶、聚戊烯基合成酶和法尼基焦磷酸合成酶。由此表明，過表達(dá)veA可能激活了冠突散囊菌萜類化合物的合成通路。

圖5 DEGs的KEGG富集氣泡圖Fig. 5 KEGG enrichment bubble diagram of DEGs

圖6 冠突散囊菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig. 6 Statistics of differentially expressed genes of secondary metabolite synthesis gene cluster in E. cristatus

2.5 基于antiSMASH 注釋相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的表達(dá)

基于antiSMASH軟件對(duì)相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，共注釋到37個(gè)基因簇545個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)合成基因，其中，顯著上調(diào)表達(dá)的基因15個(gè)，顯著下調(diào)表達(dá)的基因43個(gè)，占全部基因的10.64%。在基因簇32中，有9個(gè)差異表達(dá)基因，占該基因簇的50%，經(jīng)預(yù)測(cè)該基因簇編碼的次級(jí)代謝產(chǎn)物類型為Ⅰ型PKS類。進(jìn)一步對(duì)該基因簇進(jìn)行功能和表達(dá)量注釋，結(jié)果（表3）表明，顯著上調(diào)表達(dá)的基因多與次級(jí)代謝產(chǎn)物修飾相關(guān)，包括氧化還原酶類（SI65_05762 和SI65_05772）、甲基轉(zhuǎn)移酶（SI65_05767）、內(nèi)酰胺酶（SI65_05769）、乙酰基轉(zhuǎn)移酶（SI65_05773）和細(xì)胞色素P450單加氧酶（SI65_05771）。

表3 次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇32中基因差異表達(dá)及功能注釋Table 3 Gene expression and functional annotation in secondary metabolite gene cluster 32

3 討論

目前，基于分子水平對(duì)冠突散囊菌的研究主要側(cè)重于性別發(fā)育調(diào)控機(jī)制[17?18,21?22,25]，Tan 等[17]研究表明，veA對(duì)冠突散囊菌性別發(fā)育及氧化脅迫起調(diào)控作用。然而，veA作為全局性調(diào)控因子，對(duì)于絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的調(diào)控也有著重要作用，本研究借助農(nóng)桿菌AGL1 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功構(gòu)建了veA過表達(dá)突變株，表明根癌農(nóng)桿菌AGL1 同樣適用于侵染轉(zhuǎn)化冠突散囊菌，拓寬了冠突散囊菌分子轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)手段和材料。

本研究從過表達(dá)veA基因突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到3 種新的化合物，且發(fā)現(xiàn)多種代謝物含量與野生型存在顯著差異，表明過表達(dá)veA基因可能導(dǎo)致冠突散囊菌產(chǎn)生了某些新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步說明，veA作為全局性調(diào)節(jié)因子，可能也參與了冠突散囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控，與前人研究結(jié)果一致[9?11]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果也表明，過表達(dá)veA基因突變株的基因表達(dá)譜與野生型有較大差異，共篩選到737 個(gè)DEGs。DEGs 注釋多與催化活性、膜相關(guān)和代謝調(diào)控等過程相關(guān)。在Beauveria bassiana中敲除veA導(dǎo)致膜相關(guān)、催化活性、氧化還原酶活性和膜運(yùn)輸?shù)瘸煞值母患痆26]，與本研究結(jié)果一致，說明veA在不同菌株中的調(diào)控作用具有一定的保守性和相似性。

DEGs 的通路富集結(jié)果表明氮代謝、MAPK 信號(hào)途徑、多種氨基酸代謝及乙醛酸和二羧酸代謝等通路均有富集。在冠突散囊菌veA敲除菌株的蛋白組學(xué)研究中，10.4%的差異表達(dá)蛋白富集于氨基酸代謝通路[27]，與本研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說明veA基因可能對(duì)冠突散囊菌氨基酸代謝等通路起著重要調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，veA過表達(dá)突變株中，涉及萜類化合物骨架代謝通路的2 個(gè)編碼聚戊烯基合成酶基因及異戊二烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶基因和法尼基焦磷酸合成酶基因的表達(dá)均顯著上調(diào)，說明過表達(dá)veA可能激活了冠突散囊菌中萜類化合物合成基因簇的表達(dá)，萜類化合物是一類重要的代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等生物學(xué)活性，極具研究?jī)r(jià)值[28?29]。

基于antiSMASH 對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，結(jié)果表明，過表達(dá)veA導(dǎo)致了冠突散囊菌基因組中約10.64%的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，說明過表達(dá)veA可能激活了冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物的合成。Cary 等[30]對(duì)黃曲霉的研究表明，56個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇中有28個(gè)基因簇的表達(dá)與veA相關(guān)。張夢(mèng)薇[31]研究了過表達(dá)veA對(duì)黑曲霉轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)黑曲霉中次生代謝產(chǎn)物基因簇中32 個(gè)核心基因的表達(dá)均受到了影響，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇32 中多個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，包括1 個(gè)核心骨架基因細(xì)胞色素P450單加氧酶基因，該酶被認(rèn)為參與了多種代謝產(chǎn)物的合成和結(jié)構(gòu)修飾，如萜類化合物、甾醇以及生物堿類化合物等[28]。蒽酮類次生代謝產(chǎn)物含量的顯著提高同樣被認(rèn)為與Cytochrome P450 的表達(dá)有關(guān)[32]。由此推斷，過表達(dá)veA可能激活了以Cytochrome P450 為代表的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究為冠突散囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了新的見解和理論依據(jù)，后期可運(yùn)用多種分離純化手段和核磁共振等技術(shù)對(duì)過表達(dá)veA突變株的代謝圖譜和差異化合物進(jìn)行分離檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構(gòu)和功能的次級(jí)代謝產(chǎn)物。