草莓脫毒苗工廠化優化生產方法

伊萬偉 湯生兵

（1. 酒泉職業技術學院，甘肅 酒泉 735000；2. 酒泉龍德盛農業科技有限公司，甘肅 酒泉 735000）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，適應性強，果實柔軟多汁、甜酸適口、營養豐富，具有較高的經濟價值。目前草莓苗主要用匍匐莖進行無性繁殖，但多年的無性繁殖會使病毒累積在草莓植株體內，導致草莓病毒病頻發、品種退化嚴重。利用組織培養技術培育草莓脫毒苗是恢復草莓優良性狀、防治草莓病毒病、提高草莓產量和品質的有效途徑。

草莓脫毒苗的生產成本高，且脫毒技術復雜、脫毒周期長，給工廠化生產帶來了難度。簡化、優化草莓脫毒苗工廠化生產的環節，如直接采用莖尖脫毒培養［1］，同時在增殖培養和生根培養階段降低培養基用量，可降低脫毒苗的培養成本，促進草莓脫毒苗的規模化生產。為驗證用莖尖脫毒培養、增殖和生根培養方法培育草莓脫毒苗的效果，我們于2022年4月中旬開展了相關試驗，現將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紅顏草莓苗的匍匐莖莖尖，由酒泉龍德盛農業發展有限責任公司提供。

1.2 試驗方法

試驗設在酒泉職業技術學院生物工程學院組培室。

1.2.1 莖尖脫毒培養

4 月是草莓匍匐莖生長旺盛時期，選晴天上午取材。從無病健壯的草莓植株上剪取匍匐莖頂芽嫩梢3～5 cm，用自來水沖洗干凈后，將匍匐莖頂芽嫩梢用70%酒精浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，然后用無菌水沖洗6遍，最后將匍匐莖頂芽嫩梢置于已滅菌的濾紙上，吸干表面水分。在解剖鏡下用解剖針剝去嫩梢外層幼葉，用已消毒的解剖刀快速切取3 個不同長度帶1～2 個葉原基生長點的莖尖，莖尖長分別為0.2～0.5 mm、0.5～0.8 mm、0.8～1.0 mm，即3 個處理。將莖尖立即接種到無菌培養基（MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L）培養，培養基中添加30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂粉，將培養基pH 值調至5.75～5.85 后分裝到培養瓶中，高溫高壓滅菌后待用。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個莖尖。接種后將培養瓶放入人工氣候箱，在溫度25 ℃、黑暗條件下培養5 d，然后在溫度25 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間10 h/d條件下培養25 d。培養期間觀察草莓苗的生長情況，統計成活率和脫毒率。

脫毒率（%）=脫除病毒的葉片數/檢測葉片數×100

1.2.2 增殖培養

以培養基不同用量，即MS、1/2 MS、1/3 MS［2］為3 個處理進行草莓增殖培養。在基礎培養基中添加0.8 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂粉，將培養基pH 值調至5.75～5.85 后分裝到培養瓶中，高溫高壓滅菌后待用。將培養瓶放在溫度25 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間14 h/d條件下培養。培養期間觀察草莓芽的增殖情況。

1.2.3 生根培養

以培養基不同用量，即MS、1/2 MS、1/3 MS［2］為3 個處理進行草莓生根培養。在基礎培養基中添加0.1 mg/L NAA、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂粉，將培養基pH 值調至5.75～5.85 后分裝到培養瓶中，高溫高壓滅菌后待用。培養期間觀察草莓苗的生根情況。

2 結果與分析

2.1 莖尖大小對草莓苗成活率、脫毒率的影響

莖尖大小對草莓苗成活率、脫毒率的影響見表1。

表1 莖尖大小對草莓苗成活率、脫毒率的影響

接種不同長度的草莓莖尖均可誘導出苗，但莖尖長度對草莓苗的成活率和脫毒率影響較大，莖尖脫毒培養一般要求莖尖長度小于1.0 mm。由表1 可知，莖尖長度0.8～1.0 mm 處理草莓苗的成活率較高（86.7%）、脫毒率為0，莖尖長度0.5～0.8 mm 處理草莓苗的成活率為66.7%、脫毒率為10.2%，莖尖長度0.2～0.5 mm 處理草莓苗的成活率最低（40.0%）、脫毒率為62.0%。雖然莖尖越短，成活率越低，相對培養脫毒苗較難，但越靠近莖頂端區域，植物病毒的濃度越小，脫毒率則越高。可見，培育草莓脫毒苗應選用長度為0.2～0.5 mm 的莖尖較合適。

2.2 培養基不同用量對草莓增殖培養的影響

培養基不同用量對草莓增殖培養的影響見表2。

由表2 可知，在草莓增殖培養過程中，MS 培養基處理芽苗的增殖倍數為4.0、芽苗長勢良好，1/2MS 培養基處理芽苗的增殖倍數為3.8、芽苗長勢良好，1/3MS 培養基處理芽苗的增殖倍數為2.1；MS 培養基處理和1/2MS 培養基處理芽苗的增殖倍數、芽苗長勢差異不大，1/3MS 培養基處理芽苗的增殖倍數和生長情況顯著降低。可見，使用1/2MS培養基進行草莓增殖培養，既可保證芽苗多增殖，又可降低生產成本。

2.3 培養基不同用量對草莓生根培養的影響

培養基不同用量對草莓生根培養的影響見表3。

表3 培養基不同用量對草莓生根培養的影響

把增殖培養的叢生芽切成單株接種到生根培養基上進行培養，20 d后部分小苗基部開始膨大，逐漸出現不定根。由表3 可知，在草莓生根培養過程中，MS 培養基處理芽苗的生根率最高（92.5%）、根系長勢良好，1/2MS 培養基處理芽苗的生根率為90.6%、根系長勢良好，1/3MS 培養基處理芽苗的生根率最低（73.5%）；1/2MS培養基處理芽苗的生根效果與MS培養基處理差異不大，1/3MS培養基處理芽苗的生根率、根系長勢顯著降低。可見，用1/2MS培養基進行草莓生根培養較合適。

3 小結與討論

活躍生長的莖尖分生組織的代謝水平高能抑制病毒的繁殖，采用莖尖脫毒培養可獲得大量優質的脫毒苗。莖尖培養是培育草莓脫毒苗的常見方法，其脫毒效率高、速度快，能在較短的時間內得到原種繁殖材料，但草莓苗成活率不高。可采用莖尖脫毒培養和熱處理等多種脫毒方法相結合的方式進行草莓脫毒苗生產。如高遐虹等［3］采用二次莖尖培養的方法培育草莓脫毒苗，趙海紅［4］采用熱處理和二次莖尖培養相結合的方法培育草莓脫毒苗。多種脫毒方法相結合的方式雖然提高了脫毒率，但規模化生產效率并未得到顯著提高，可能是脫毒流程多、操作步驟繁瑣、時間長和操作失誤等原因所致。

在莖尖脫毒培養中，要求莖尖長度小于1.0 mm，靠近頂端的莖尖脫毒率較高，但在實際操作過程中，小的莖尖于接種培養2 周內易變為褐色而枯死，成活率較低。因此莖尖的取材和消毒非常重要。一般選晴天上午取材，利于莖尖的剝離和培養；由于外植體來自于田間，附有大量細菌，需嚴選消毒劑種類和濃度、消毒時間，如外植體需用70%酒精液浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，然后用無菌水沖洗6遍。此消毒方法對外植體的消毒效果較好，對莖尖的損傷也較小。

草莓脫毒苗工廠化生產應綜合考慮生產效率、脫毒效率和生產成本，以獲得較高的經濟效益。試驗結果表明，采用長度為0.2～0.5 mm 的莖尖、1/2 MS 培養基培育草莓脫毒苗，雖然成活率較低，但脫毒率較高，既可簡化脫毒環節、保證芽苗的增殖倍數、提高生根效果，又可降低生產成本，在保證一定的脫毒率和成活率的同時提高生產效率。