miR-181b-5p調節EGR1/BIM通路對ALL細胞增殖、凋亡和遷移的影響*

袁韻 王婷 胡艷

(1.四川大學華西護理學院,四川 成都 610041;2.四川大學華西醫院血液內科,四川 成都 610041)

急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種常見的血液系統惡性腫瘤,其特點是骨髓浸潤和肝、脾、淋巴結中淋巴母細胞的積累[1-2]。盡管ALL的治療取得了重大進步,但仍有部分ALL患者復發后難以緩解[3]。因此,迫切需要探索治療ALL的新策略。miRNA在ALL和慢性淋巴細胞白血病中發揮關鍵作用,在靶向分子治療和預后評估等方面具有良好的應用前景[4]。miR-181家族是許多生物過程中的重要調節分子,包括免疫反應、細胞增殖、凋亡、線粒體功能和自噬[5]。miR-181a已經被證實在ALL細胞中充當腫瘤促進miRNA,可通過調節腫瘤抑制基因早期生長反應因子1(Early growth response 1,EGR1)的表達影響細胞的周期進程[6]。且已有研究證明,攜帶miR-181b-5p的細胞外囊泡可促進ALL的惡性進展[7]。生物信息學預測顯示EGR1是miR-181b-5p的潛在靶基因。EGR1是控制造血干細胞增殖的關鍵轉錄因子之一,EGR1激活并招募造血干細胞使其增殖和分化以產生成熟的血細胞,其失調與血液惡性腫瘤相關,包括ALL[8]。據報道,在ALL中EGR1表達降低,升高其表達可誘導ALL細胞凋亡并抑制細胞增殖[9]。然而,miR-181b-5p在ALL細胞中的具體作用及機制尚不清楚。本研究旨在通過分析miR-181b-5p對ALL細胞增殖、遷移和凋亡的影響,同時驗證miR-181b-5p和EGR1之間的靶向關系,以期尋找一個有希望的ALL治療靶點,并揭示ALL治療的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入四川大學華西醫院2019年1月—2021年1月80例ALL患者(ALL組)。ALL診斷標準根據是“國家ALL診斷和治療建議”[10]。參考文獻[11]將所有ALL患者分為24例標準風險(標準風險-ALL組)、35例中等風險(中等風險-ALL組)和21例高等風險(高等風險-ALL組)。同時收集我院無惡性血液病志愿者30例作為對照組。ALL患者的最小年齡為4歲,最大為48歲,平均年齡為18.17歲,其中男性53例,女性27例。對照組的最小年齡為4歲,最大年齡為47歲,平均年齡為20.60歲,其中16人為男性,14人為女性。本研究經我院倫理委員會批準。所有涉及的參與者均提供了知情同意書。

1.2 細胞和主要試劑 Trizol RNA提取試劑(9108-1)、PrimeScript RT試劑盒(RR047AA)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201)購自日本TAKARA,人ALL細胞系NALM-6(HTX1901C)購自深圳華拓生物,miR-181b-5p模擬物/抑制物(miR-181b-5p mimics/inhibitor)及其陰性對照(NC-mimics/inhibitor)均購自上海GenePharma,EGR1過表達載體(EGR1)及其空載(Vector)均購自廣州Ribo Bio,Lipofectamine 3000(L3000015)購自美國Invitrogen,MTT細胞活力檢測試劑盒(8028)購自美國ScienCell,Annexin V FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(CA001)購自美國SAB,雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(11402ES60)購自上海YEASEN,Bicinchoninic Acid Protein Assay試劑盒(abx097193)購自英國Abbexa,一抗EGR1(4154S)、BIM(2933T)、Cyclin D1(55506T)、C-caspase-3(9664T)、MMP-2(87809S)、MMP-9(13667T)和β-actin(4970T)購自美國Cell Signaling Technology。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測miR-181b-5p和EGR1 mRNA相對表達水平 通過Trizol提取總RNA,并通過PrimeScript RT試劑盒獲得cDNA,使用SYBR Green法在ABI 7500 HT快速實時PCR系統上進行miRNA和mRNA定量。U6用作miRNA相對定量的內部對照,β-actin用作mRNA相對定量的內部對照。使用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達水平。引物序列如下:miR-181b-5p正向為5′-GTTTGAAC ATTCATTGCTGTCG-3′,反向為5′-GTGCAGGGT CCGAGGT-3′;EGR1正向為5′-AGCTGTGCAGTG CAGTCCAACGAC-3′,反向為5′-TAGTCGGGGAT CATGGGAACCTG-3′;U6正向為5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′,反向為5′-AACGCTCTCACGAA TTTGCGT-3′;β-actin正向為5′-ACACCTTCTAC AATGAGCTG-3′,反向為5′-CTGCTTGCTGATCC ACATCT-3′。

1.3.2 細胞培養與分組 采用10%胎牛血清和1%鏈/青霉素的Dulbecco改良Eagle培養基,在5%CO2培養箱中于37 ℃培養NALM-6細胞。使用Lipofectamine 3000轉染生長到80%匯合的NALM-6細胞。NALM-6細胞分為NC-mimics組(轉染NC-mimics)、miR-181b-5p mimics組(轉染miR-181b-5p mimics)、NC-inhibitor組(轉染NC-inhibitor)和miR-181b-5p inhibitor組(轉染miR-181b-5p inhibitor)。此外,為了進一步探究miR-181b-5p對ALL的作用機制,將NALM-6細胞分為Vector組(轉染Vector)、EGR1組(轉染EGR1)和miR-181b-5p mimics+EGR1組(共轉染miR-181b-5p mimics和EGR1)。未被轉染的細胞被認為是Blank組。所有細胞均在37 ℃培養箱培養48 h。通過qRT-PCR驗證轉染效率見表1。

表1 4組miR-181b-5b mRNA表達水平

1.3.3 MTT法檢測細胞活力 將各組轉染的NALM-6細胞(2×104個/孔)種植到96孔板中。培養24 h后將20 μL MTT添加到每個孔中,并將板在37 ℃下孵育3～4 h。然后去除MTT試劑,并添加150 μL DMSO以溶解甲臜。使用酶標儀在490 nm處測量吸光度。

1.3.4 Annexin V FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 將各組轉染的NALM-6細胞(5×105個)以1000 rpm的速度離心5 min,然后將細胞重懸于0.5 mL結合緩沖液中,在細胞懸浮液中添加5 μL Annexin V FITC和PI溶液。將細胞在室溫下避光孵育5 min,并在30 min內通過流式細胞儀進行分析。

1.3.5 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 將各組轉染的NALM-6細胞(1×105個/孔)接種到6孔板中,培養至細胞達到90%匯合。使用200 μL微量移液器尖端在每個孔的中間垂直劃傷細胞并洗滌去除懸浮細胞。培養細胞24 h,拍攝0 h和24 h細胞圖片,Image-J軟件測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%。

1.3.6 雙熒光素酶檢測熒光素酶活性 生物信息學分析預測miR-181b-5p在EGR1 3′-UTR上的潛在結合位點。產生具有野生型(WT)或突變型(MUT)miR-181b-5p結合位點的EGR1并克隆到pmirGLO載體構建EGR1 WT和EGR1 MUT。然后將EGR1 WT/EGR1 MUT與NC-mimics/miR-181b-5p mimics通過Lipofectamine 3000共轉染到NALM-6細胞中48 h。通過雙熒光素酶報告基因系統檢測熒光素酶活性。

1.3.7 蛋白質印跡檢測蛋白表達水平 NALM-6細胞通過預冷的裂解緩沖液裂解得到總蛋白。通過Bicinchoninic Acid Protein Assay試劑盒對蛋白質濃度進行檢測。蛋白質樣品在SDS-PAGE中分離,并轉移到PVDF膜上。將膜與一抗EGR1、BIM、Cyclin D1、C-caspase-3、MMP-2、MMP-9和β-actin(內參)在4 ℃下孵育過夜。隨后將膜與二抗在25 ℃下孵育1 h。通過增強型化學發光法使蛋白質可視化,并通過Quantity One 1-D軟件進行量化。

2 結果

2.1 miR-181b-5p在ALL患者中的表達水平 兩組觀察對象的臨床病理特征見表2。與對照組相比,ALL組miR-181b-5p表達顯著上調(P<0.05);中等風險-ALL組miR-181b-5p的表達顯著高于標準風險-ALL組(P<0.05),高等風險-ALL組miR-181b-5p的表達顯著高于中等風險-ALL組(P<0.05),見圖1。結果表明ALL中miR-181b-5p表達增加,尤其是高等風險-ALL組。

圖1 miR-181b-5p在ALL中表達水平

表2 兩組臨床病理特征

2.2 miR-181b-5p對ALL細胞惡性生物學行為的影響 與NC-mimics組相比,miR-181b-5p mimics組NALM-6細胞活力、劃痕愈合率顯著增高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與NC-inhibitor組相比,miR-181b-5p inhibitor組NALM-6細胞活力、劃痕愈合率顯著降低,細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 miR-181b-5p對ALL細胞凋亡和遷移的影響

表3 miR-181b-5p對ALL細胞惡性生物學行為的影響

2.3 miR-181b-5p與ALL細胞中EGR1的表達存在相互作用關系 生物信息學技術預測了EGR1 3′-UTR中miR-181b-5p的結合位點;雙熒光素酶結果顯示,與共轉染NC-mimics和EGR1 WT的NALM-6細胞相比,共轉染miR-181b-5p mimics和EGR1 WT的NALM-6細胞中相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖3。qRT-PCR檢測兩組EGR1的表達結果顯示,與對照組相比,ALL組EGR1的表達明顯降低(P<0.05)。中等風險-ALL組EGR1表達顯著低于標準風險-ALL組(P<0.05),高等風險-ALL組EGR1表達顯著低于中等風險-ALL組(P<0.05),見圖4。提示,EGR1在ALL中的表達下調,尤其是在高等風險-ALL組。進一步上調miR-181b-5p可顯著降低EGR1 mRNA表達(P<0.05),下調miR-181b-5p可明顯升高EGR1 mRNA表達(P<0.05),見圖5。

圖3 Starbase網站預測miR-181b-5p與EGR1的結合位點及雙熒光素酶測定結果

圖4 EGR1在ALL中表達水平

圖5 miR-181b-5p對EGR1 mRNA表達的影響

2.4 miR-181b-5p過表達削弱了EGR過表達對ALL腫瘤發生的抑制作用 為了進一步探索EGR1是否參與了miR-181b-5p在ALL細胞中的作用,構建EGR1過表達質粒后轉染到NALM-6細胞中,轉染后EGR1 mRNA水平顯著增高(P<0.05),然后用于后續研究。與Vector組相比,EGR1組NALM-6細胞活力、劃痕愈合率顯著降低,細胞凋亡率顯著增高(P<0.05);與EGR1組比較,miR-181b-5p mimics+EGR1組NALM-6細胞活力、劃痕愈合率顯著增高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖6、表4。

圖6 miR-181b-5p過表達削弱了EGR過表達對ALL腫瘤細胞凋亡和遷移的影響

表4 miR-181b-5p過表達削弱了EGR過表達對ALL腫瘤發生的抑制作用

2.5 miR-181b-5p調節EGR1/BIM通路對ALL腫瘤發生相關蛋白表達的影響 結果顯示,與Vector組相比,EGR1組NALM-6細胞中EGR1、BIM和C-caspase-3蛋白水平增高,Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平降低(P<0.05);與EGR1組比較,miR-181b-5p mimics+EGR1組NALM-6細胞中EGR1、BIM和C-caspase-3蛋白水平降低,Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平增高(P<0.05),見圖7、表5。

圖7 Western blot檢測細胞中EGR1、BIM、Cyclin D1、C-caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平

表5 miR-181b-5p調節EGR1/BIM通路對ALL腫瘤發生相關蛋白表達的影響

3 討論

ALL是一種以淋巴細胞發育異常、分化異常為特征的血液系統性腫瘤,形成大量未成熟的白細胞[1-2]。miRNA的異常表達與ALL的腫瘤發生有關[12]。以往研究顯示,miR-181家族具有抑癌和致癌雙重功能,是腫瘤診斷與治療的潛在靶點[13-14]。有研究表明,miR-181b-5p在ALL細胞系中高表達[7]。因此,推測miR-181b-5p在ALL的發生和發展中起關鍵作用。本研究發現ALL患者中miR-181b-5p表達升高,且在高危ALL患者中表達最高。本實驗功能研究結果顯示,過表達miR-181b-5p可明顯促進ALL細胞的增殖和遷移,抑制細胞凋亡;轉染miR-181b-5p抑制物阻斷miR-181b-5p表達可抑制ALL細胞的遷移和侵襲,促進細胞凋亡。以上結果提示miR-181b-5p通過促進ALL細胞增殖、遷移和抑制細胞凋亡來誘發ALL的惡性進展。因此,下調miR-181b-5p的表達可能是治療ALL的新靶點。

EGR1是一種鋅指轉錄因子,可調節細胞增殖、分化和凋亡。EGR1在實體癌中表達失調,并作為癌基因或腫瘤抑制因子發揮作用,具體取決于癌癥的階段和類型[15-16]。EGR1已被表征為白血病和多發性骨髓瘤中的腫瘤抑制因子[17]。EGR1可作為miRNA的下游靶標發揮其腫瘤調節功能[18]。生物信息學預測發現,EGR1可能是miR-181b-5p的下游靶基因。本研究通過對ALL患者中EGR1 mRNA水平進行檢測,發現其在ALL中呈低表達。雙熒光素酶證實,miR-181b-5p與EGR1存在相互作用,且上調miR-181b-5p可抑制EGR1表達,下調miR-181b-5p可促進EGR1表達,提示miR-181b-5p負靶向調控EGR1在ALL中發揮促癌功能。此外,本研究發現,上調miR-181b-5p可明顯削弱EGR1過表達對ALL細胞增殖、遷移的促進作用以及對細胞凋亡的抑制作用。提示miR-181b-5p可能通過抑制EGR1的表達來促進ALL的發展。

據報道,BIM編碼一種來自BCL-2家族的細胞凋亡相關蛋白,可充當細胞凋亡激活劑[19]。已有報道顯示,EGR1可通過與BIM的啟動子結合,觸發其表達,進而觸發腫瘤細胞死亡[20]。本研究結果顯示,過表達EGR1可促進BIM表達,同時上調凋亡相關蛋白C-caspase-3的表達,下調增殖相關蛋白Cyclin D1和遷移相關蛋白(MMP-2和MMP-9)水平。表明EGR1可能通過與BIM結合調控ALL細胞惡性行為相關蛋白的表達進而影響細胞增殖、遷移和凋亡。進一步的研究顯示,上調miR-181b-5p可削弱EGR1對BIM表達的影響。提示miR-181b-5p可能通過調節EGR1/BIM通路進而影響ALL細胞增殖、凋亡和遷移。本研究補充了miR-181家族成員miR-181b-5p可能作為ALL的潛在治療靶點。但miR-181b-5p在ALL的詳細作用機制仍需進一步研究。

4 結論

miR-181b-5p表達水平在ALL中上調。下調miR-181b-5p可通過激活EGR1/BIM通路抑制ALL細胞增殖、遷移并促進細胞凋亡。