基于網絡藥理學和分子對接法初步探索小兒清熱止咳口服液抗病毒性肺炎的研究

胡旭華 謝德隆

（上海天慈生物谷生物工程有限公司 上海 201315）

小兒清熱止咳口服液收錄于2020 版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》），由麻黃、苦杏仁、石膏、黃芩、板藍根、甘草、北豆根七味藥配制蜂蜜蔗糖等輔料制成，用于小兒外感風寒所致的感冒。方中麻黃辛甘溫，溫肺解表而平喘；石膏辛甘大寒，清泄肺胃之熱以生津，兩藥相輔相成，既能宣肺，又能清熱，共為君藥。杏仁味苦，降利肺氣而平喘咳，與麻黃相配則宣降相因，與石膏相伍則清肅協同，是為臣藥。再以苦寒之黃芩清肺瀉火解毒，板藍根、北豆根清熱解毒利咽。全方配伍則寒熱除，腫痛消，共奏清熱，宣肺，平喘，利咽之功。該方是在出自《傷寒論》的麻杏石甘湯基礎上增加了黃芩、板藍根、北豆根三味藥[1]。麻杏石甘湯是抗病毒性感冒的常用制劑[2]，小兒清熱止咳口服液在該方基礎上加以改進，增強了抗病毒、止咳、抗炎和平喘的療效[3]。

兒童病毒性肺炎容易對呼吸系統、循環系統和中樞神經系統引起損傷，是多病毒引起的兒科常見病，臨床治療以對癥和支持治療為主。兒童是傳染病的易感和高發人群，身體各項機能尚不完善，若不能及時診斷和治療，易出現各種并發癥，危害身體健康[4]。此外兒童用藥與成年人不同，不宜使用有明顯毒副作用的藥物，而小兒清熱止咳口服液已有多年臨床使用經驗，毒副作用較小。本文在已知其抗病毒作用基礎上，采用網絡藥理學等工具進行理論推導以期通過理論活性成分為基礎探索其抗病毒性肺炎的作用及機制，為研制出適用于兒童的藥物提供理論依據。

1 工具與方法

1.1 數據庫和工具

數據庫：中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP,http://tcmspw.com/index.php）；中藥分子機制生物信息學分析工具（BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；中國知網數據庫；DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/）；STRING 數據庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）；蛋白質結構數據庫（Protein Data Bank,PDB）。

工具：Cytoscape 3.6.0；SwissDock 分子對接在線平臺；PyMol 軟件。

1.2 小兒清熱止咳口服液有效成分篩選

在TCMSP 數據庫及BATMAN-TCM 數據庫中搜索小兒清熱止咳口服液6 味藥（不含石膏）的所有化學成分，以吸收、分布、代謝、排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）參數中的口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性（drug-like,DL）≥0.18 為篩選條件，得到每味藥的活性成分。為避免個別認可度較高的活性成分被篩選掉，故同時查閱《中國藥典》（2020 年版）與中國知網數據庫中相關文獻，得到此類成分并合并至上述篩選結果中，并從TCMSP數據庫下載這些活性成分的靶點信息。

1.3 靶點網絡的構建和分析

應用DisGeNET 數據庫檢索得到肺炎相關靶點，將成分和疾病靶點取交集后得到小兒清熱止咳口服液抗病毒的關鍵靶點。再將“方劑-藥材-化合物-靶點-疾病”的藥理網絡導入Cytoscape 3.6.0 軟件，構建小兒清熱止咳口服液的藥理網絡和蛋白相互作用（proteinprotein interaction,PPI）網絡，并應用該軟件中“Network Analyzer”功能進行網絡分析，根據度值（degree）篩選小兒清熱止咳口服液抗病毒的重要成分和關鍵靶點。

1.4 關鍵靶點功能富集分析

對篩選所得重要靶點應用STRING 平臺KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，獲知小兒清熱止咳口服液產生抗病毒感染、肺部損傷作用的相關信號通路，分析其作用機制。

1.5 分子對接驗證

應用SwissDock 在線分子對接軟件預測目標蛋白和小分子之間可能發生的分子相互作用。根據“成分-靶點”網絡中重要的成分和PPI 網絡中的靶蛋白，以評價成分與靶點之間的對接效果。

2 結果

2.1 活性化合物及疾病靶點篩選結果

通過TCMSP 數據庫檢索，符合條件的化合物共有220 個，從這些活性成分獲得262 個作用靶點。在DisGeNET 數據庫中篩選疾病對應的靶點，獲得疾病相關靶點621 個，與成分的靶點取交集得到62 個關鍵靶點。

2.2 構建化合物-靶點網絡、靶點-疾病網絡和PPI

靶點網絡的構建和分析：將220 個成分與62 個靶點在Cytoscape 3.6.0 軟件中構建小兒清熱止咳口服液成分-靶點網絡（圖1，其中活性成分以橙色方形標示，關鍵靶點以藍色方形標示），共涉及146 個節點和440 條邊。采用度值評價，篩選10 個抗病毒的關鍵成分：山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩苷、芒柄花黃素、刺槐素、麻黃堿、甘草黃酮、異鼠李素和青藤堿。

圖1 “成分-靶點”網絡

采用Cytoscape 3.6.0 軟件構建PPI 網絡（圖2），并利用MCODE 插件分解關鍵靶點網絡（圖3），3 個連接緊密的子模塊被識別，其中1 個6-核子模塊為與炎癥相關蛋白間相互作用；2 個4-核子模塊為與抗病毒作用相關蛋白間相互作用、與細胞分裂作用相關蛋白之間的相互作用。

圖2 蛋白相互作用網絡

圖3 關鍵靶點網絡中的3個連接緊密的子模塊

2.3 關鍵靶點干預疾病過程富集分析

將62 個靶點輸入STRING 功能富集分析，設定統計指標為錯誤發現率（false discovery rate,FDR）＜1×10－6，在KEGG 通路富集的結果中限定人類疾病（human diseases）部分的通路，得到55 個靶標富集的疾病通路，其中12 個通路與病毒感染、肺部損傷相關（表1）。

表1 關鍵靶點KEGG通路富集分析

2.4 分子對接驗證

選擇小兒清熱止咳口服液中的麻黃堿和黃芩素，與PPI 網絡中抗病毒重要靶點RelA、MAPK14、IL-1B 進行分子對接驗證。在PDB 數據庫下載靶點晶體結構文件，用PyMol 軟件移去水分子和配體分子，在Swiss Dock 在線軟件分別上傳靶蛋白和麻黃堿以及黃芩素的結構文件。分子對接結果如表2 所示，蛋白質與小分子結合越緊密，full f itness 值越低，表明2 個成分與RelA、MAPK14、IL-1B 都可對接且對接效果較好。

表2 分子對接結果

3 討論

本文利用網絡藥理學和分子對接技術工具，分析“小兒清熱止咳口服液”組方成分抗病毒性肺炎的作用機制。基于研究對象、研究思路和工具，本研究屬于中西醫結合研究。為了更好地說明問題，本研究假設文中所列成分均在血液中發現[5-6]。

近年來，越來越多的研究關注于血清藥物化學/藥理學。其基本思想是，中藥一般經口服用后在體內會經過吸收、分布、代謝等過程，可能形成含有中藥的原型成分、代謝產物及機體藥物作用下產生的新的內源性生理活性物質的成分群，通過血液運輸到各個器官組織或靶點，并在達到一定的血藥濃度時才能發揮藥效。因此研究血清藥物化學/藥理學才能真正揭示中藥的物質基礎和作用機制。但當前，針對單味藥或復方的血清藥物化學/藥理學還比較少，且很多研究未更深入闡釋。比如董宇等[7]的益胃飲中藥血清藥物化學研究及鄧哲等[8]研究下瘀血湯的血清物質基礎和藥理學，均揭示了復方中的化學成分，但是缺乏與藥效或藥代動力學的結合，特別是能發現與藥效至關重要的成分及其相互關系。未來的研究應著重研究復方的化學成分本質，去偽存真，為創造更好的藥物提供思路或原型。

針對本復方的君藥和臣藥——麻黃和苦杏仁（石膏成分簡單），當前采用血清藥物化學/藥理學方法研究上述藥物及相關復方的文獻較少。具有代表性的僅有唐鋒等[6]研究麻黃附子細辛湯的血清物質基礎和藥理學。因此可參考的實驗資料較少，同時這也是該領域今后的重要工作之一。

此外，我們并不假定所有成分均達到發揮生物效應的濃度，因為中藥復方是一個整體。劉德麟等[9]提出了藥效分子群和藥效分子組合的概念，這可能比以化學單體來理解中藥更符合實際。

病毒性肺炎是病毒下蔓延，侵入肺后產生炎癥，屬于肺功能障礙的疾病[10]。臨床以利巴韋林等抗病毒藥物治療本病，但療效不佳、不良反應較多。清熱解毒類中醫方劑對本病有顯著療效。本研究運用網絡藥理學和分子對接技術研究發現，小兒清熱止咳口服液抗病毒的關鍵成分：山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩苷、芒柄花黃素等；KEGG 通路分析結果中以IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染等通路較為靠前，這些作用靶點與病毒感染、肺部損傷等密切相關。IL 是參與體內炎癥反應的物質，史東林等[11]用ELISA 檢測肺部感染患者感染前后IL 水平，發現感染后IL-17 等水平明顯上升。MAPK[12]是細胞質中高度保守的絲氨酸蛋白激酶，在許多細胞因子的信號傳遞中起著重要的中介作用，其中p38 是調節細胞因子如IL-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）表達的重要細胞內信號通路，參與體內的炎癥反應，作為小兒清熱止咳口服液的重要通路，說明該處方通過抗炎和阻止病毒侵犯上皮細胞，起到抗病毒性肺炎的作用。

RelA 是一種抗病毒轉錄因子。核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor,NF-κB）參與多種疾病的發病過程由5 個成員組成：p50、p52、p65（RelA）、c-Rel 和RelB，它們分別表達為相應的蛋白質NF-κB1、NF-κB2、RelA、Rel 和RelB，活化后與基因啟動子區域的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄。有數量驚人的信號能夠激活NF-κB，它們包括細菌、病毒和真菌的產物以及炎癥細胞因子、氧化壓力和治療用的藥物。Bais 等[13]人闡明了依賴RelA 的生存因子，抑制了感染引起的細胞死亡，阻止了RELA 缺陷細胞中Chandipura 病毒的增殖。

《中國藥典》（2020 年版）中收載的小兒清熱止咳口服液以出膏率、麻黃堿含量、黃芩苷含量為指標，黃芩苷是該制劑發揮抗病毒作用的重要成分，以其含量為指標，保證其發揮抗病毒的療效。本文運用網絡藥理學方法，通過整合數據庫內信息，挖掘出小兒清熱止咳口服液對病毒性肺炎潛在的治療作用，為拓寬其臨床使用范圍提供理論依據。