強骨抗萎膏通過調控MFN2及抑制內質網應激改善失重狀態下大鼠骨丟失

史長華，田雷瑜，馮 婧，李姝玉，劉軍蓮，劉雨夢，劉嘉鵬，王 謙*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.中國航天員科研訓練中心，北京 100094）

太空飛行中的失重引起的骨質疏松，是損害宇航員健康的重要危險因素。失重導致肌肉、骨骼系統結構和功能變化，主要表現為骨質疏松、骨架脫鈣和骨性退化等[1]。中醫藥在抑制骨質流失方面歷史悠久，被廣泛應用于航天醫學的研究領域。課題組前期研究發現，強骨抗萎膏可改善失重狀態下骨的生物力學特性，促進骨礦鹽的沉積，增強骨密度，減少骨質丟失，并能增強骨的代謝功能[2-4]。

內質網是蛋白質合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。在應激原刺激下，細胞會發生內質網應激（endoplasmic reticulu mstress，ERS）。當細胞內發生錯誤折疊蛋白累積、自噬不足、鈣超載、氧化應激、炎癥和缺氧時，ERS被激活[5]。適應性ERS可以觸發未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）糾正錯誤折疊蛋白并促進蛋白清除能力[5-6]，UPR通過三個主要分支傳遞信號：蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK），肌醇依賴性激酶 1（IRE1）和活化轉錄因子 6（ATF6）途徑。ERS發生時，內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白78（GRP78）親和力下降，與PERK、IRE1和ATF6分離，然后激活下游信號分子，如C/EBP同源蛋白（CHOP）[7]。線粒體是細胞產生能量的主要場所。線粒體融合蛋白MFN2在調控線粒體運動和細胞凋亡中發揮重要作用[6，8]。MFN2出現在內質網與線粒體結合部位，越來越多的證據表明，內質網和線粒體之間的特定互動和合作是細胞功能所必需的[8]。研究發現，在微重力或力學負荷作用下，細胞功能的變化伴隨著內質網應激和線粒體分裂融合的運動狀態而改變[9]，造成細胞凋亡，其發生機理尚未闡明。

本研究在前期研究基礎上，著重觀察強骨抗萎膏對模擬失重的尾吊大鼠骨細胞凋亡，內質網應激相關蛋白 GRP78，PERK、IRE1α、ATF6和 MFN2 表達的作用，闡釋強骨抗萎膏對失重致骨丟失的影響及其可能的分子機制，為中藥臨床防治失重后骨丟失提供實驗依據。

1 實驗動物及試劑

1.1 實驗動物 實驗采用的SPF級雄性SD大鼠購自中國食品藥品檢定研究院 [許可證號：SCXK（京）2017-0005]。按照實驗動物使用的3R原則給予關懷。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 實驗藥物和試劑 強骨抗萎膏由航天員科研訓練中心提供，由熟地、骨碎補、龜板、懷牛膝等按比例組成（生成批號：2171101）。阿侖膦酸鈉（石藥集團歐意藥業有限公司，批準文號H20061303）。骨疏康顆粒（遼寧康辰藥業有限公司，批準文號Z20060270）。BCA蛋白測定試劑盒、蛋白Marker與ECL發光試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；GRP78和CHOP單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗大鼠PERK、IRE1α、ATF6和MFN2多克隆抗體購自Cell Signaling公司；大鼠單克隆抗體GAPDH和HRP標記的羊抗兔IgG購自美國proteintech公司；HiFiScript gDNA Removal TM RT Master Mix試劑盒及UltraSYBR Mixture購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司。

1.2.2 儀器和設備 SynergyⅡ型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；熒光定量 PCR 儀（CFX96）、Bio-Rad垂直電泳系統、Bio-Rad濕法電轉印系統（伯樂生命醫學產品有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組 實驗動物分為對照組、模擬失重組、強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組，骨疏康顆粒組；大鼠體質量400 g左右，每組12只。模擬失重組：按照Morey-Holton的尾部懸吊28天模擬失重[10]。后肢懸垂與頭部約成30°夾角，大鼠可做旋轉活動和自由飲食，光照黑暗時間各12 h。對照組和模擬失重組為正常飲食和光照，每日灌服生理鹽水。其它3組按上述方法復制模型，同時分別每日給予強骨抗萎膏2.4 g/kg；阿侖膦酸鈉0.007 g/kg和骨疏康顆粒0.26 g/kg。

2.2 TUNEL染色檢測凋亡 大鼠脫頸處死后，快速分離出完整的股骨組織，取部分骨于4%多聚甲醛溶液中固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋切片，并進行TUNEL染色，蘇木素復染，脫水封片。在光學顯微鏡下（×20）觀察骨細胞凋亡情況。核棕色為陽性，藍色為陰性，使用Image J軟件進行統計。

2.3 RT-PCR檢測大鼠骨組織中 PERK、CHOP、IRE1α及ATF6 mRNA的表達水平 分別提取各組大鼠骨組織總RNA，逆轉錄成cDNA作為RT-PCR的模板。由上海生工設計并合成 PERK、CHOP、IRE1α、及ATF6的引物序列（表1），以GAPDH 作為內參照，通過2－ΔΔCt法比較各組大鼠骨組織mRNA的相對含量。

2.4 Western blot檢測大鼠骨組織中GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、CHOP及MFN2蛋白的表達水平 提取骨組織蛋白進行濃度測定。Western blot檢測各組大鼠骨組織中 GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、CHOP 及MFN2的表達水平，以GAPDH為內參，利用目的蛋白與內參的光密度比值作為相對表達量，對各組數值進行比較分析。

2.5 數據分析 數據若無說明均采用均數±標準差（mean±SD）表示。采用統計軟件SPSS 20.0進行統計分析。結果中多組比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 骨細胞凋亡檢測 TUNEL染色結果表明，對照組有個別細胞凋亡，與對照組相比，模擬失重組大鼠骨凋亡細胞數量增多（P<0.05）；與模擬失重組相比，強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組凋亡細胞數量減少（P<0.05）），差異具有統計學意義，見圖1。

圖1 各組大鼠細胞凋亡情況

3.2 Western blot檢測各組大鼠骨組織內質網應激分子GRP78蛋白的表達 Western blot的結果顯示，GRP78蛋白表達量模擬失重組明顯高于對照組（P<0.05），強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠骨組織GRP78蛋白表達

3.3 各組大鼠骨組織內質網應激相關通路分子PERK、CHOP、IRE1α 和 ATF6 mRNA的表達水平

RT-PCR檢測結果顯示模擬失重組PERK mRNA表達顯著高于對照組（P<0.01），強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組明顯降低（P<0.01）。CHOP、IRE1α和ATF6 mRNA表達量水平在各組間無明顯差異，見圖3。

圖3 各組大鼠骨組織PERK、CHOP、IRE1 α和ATF6 mRNA的表達

3.4 Western blot檢測各組大鼠骨組織PERK及CHOP蛋白的表達 Western blot的結果顯示，PERK和CHOP蛋白表達量模擬失重組明顯高于對照組（P<0.05），強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著降低（P<0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠骨組織PERK及CHOP蛋白表達

3.5 Western blot檢測各組大鼠骨組織IRE1α和ATF6蛋白的表達 Western blot的結果顯示，IRE1α蛋白表達量各組間無明顯差異。ATF6蛋白表達量模型組明顯高于對照組（P<0.01），強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著降低（P<0.01），見圖5。

圖5 各組大鼠骨組織IER1α和ATF6蛋白表達

3.6 Western blot檢測各組大鼠骨組織MFN2蛋白的表達 Western blot結果顯示，MFN2蛋白表達量模擬失重組明顯低于對照組（P<0.01），強骨抗萎膏組、阿侖膦酸鈉組和骨疏康顆粒組較模擬失重組顯著增高（P<0.01），見圖6。

圖6 各組大鼠骨組織MFN2蛋白的表達

4 討論

中醫認為“腎主骨”，骨骼改變與腎密切相關[11]。故較多研究者從腎論治，開展中醫藥改善失重大鼠承重骨丟失的相關研究[12]。本課題組近年選用強骨抗萎膏治療骨質疏松取得較好療效[2-4]。強骨抗萎膏主要由熟地、骨碎補、龜板、懷牛膝等組成。骨碎補藥用部分為水龍骨科附生槲蕨的干燥根莖，主要活性成分為黃酮類化合物。研究表明，骨碎補或其提取物能促進成骨細胞和破骨細胞的增殖和分化，并調節成骨細胞轉錄因子活性[13-14]。骨碎補總黃酮可促進IL-1β介導的軟骨肉瘤細胞的增殖并抑制細胞凋亡[15]。本實驗中強骨抗萎膏組較模擬失重組降低了成骨細胞凋亡，說明強骨抗萎膏在一定程度上可以緩解失重狀態下骨丟失的進程。

GRP78是ERS中一個重要的分子伴侶，被認為是ERS的標志性蛋白之一。在長時間或過強的ERS反應時，UPR的所有3個分支PERK、IRE1以及ATF6與GRP78分離后，均可誘導CHOP的轉錄表達。CHOP是ERS介導細胞凋亡的特異轉錄分子[16]。本實驗中，與對照組相比，模擬失重大鼠骨組織GRP78、PERK和ATF6表達量顯著增高，說明失重使實驗動物骨組織發生了ERS。模擬失重組與對照組相比CHOP表達水平升高，表明CHOP途徑可能是失重環境引起大鼠骨組織細胞凋亡的機制之一；與模擬失重組比較，強骨抗萎膏、阿侖膦酸鈉和骨疏康顆粒組，GRP78、PERK、ATF6和CHOP蛋白表達降低，說明強骨抗萎膏能減輕 ERS程度與抑制GRP78、PERK、ATF6和CHOP蛋白表達有關。本研究發現強骨抗萎膏降低了ATF6和CHOP的蛋白水平，而不影響其mRNA的表達，推測強骨抗萎膏可能通過增加ATF6和CHOP的降解而不是降低其產生來調節ATF6和CHOP。

MFN2是一種含有757個氨基酸高度保守的線粒體蛋白，具有GTPase活性。MFN2位于線粒體外膜上，在線粒體融合中起關鍵作用。早在2008年，研究發現，MFN2富集在內質網和線粒體之間的接觸點，調節內質網和線粒體的形態[17]。在MFN2敲低的細胞中，內質網和線粒體之間的距離增加，導致線粒體Ca2+攝取受損，干擾線粒體Ca2+平衡[18-19]。也有學者發現，MFN2表達降低后增加了內質網和線粒體之間的距離，使細胞對鈣離子凋亡信號更敏感[20]。另有研究表明，MFN2高表達通過促進內質網的鈣離子大量涌入線粒體，造成線粒體鈣超載引發凋亡[21]，具體機制有待進一步探索。本研究證實，失重狀態可誘導內質網應激和細胞凋亡，MFN2表達降低，強骨抗萎膏可增加MFN2的表達，提高MFN2能保護骨組織免受內質網應激引起的細胞凋亡，在一定程度上保護失重狀態下骨組織的丟失。提示強骨抗萎膏可通過上調MFN2的表達緩解失重帶來的內質網應激損傷。

綜上所述，強骨抗萎膏能明顯降低骨組織細胞凋亡水平，減緩ERS進程，其機制可能與調控MFN2的表達、抑制ERS的激活有關，但具體的分子機制有待于進一步探討。