雪上一枝蒿多糖組分XP-10體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)作用及機制研究

彭 磊，張 霞，左愛學(xué)，劉 穎，李斯文，方肇勤*，萬春平*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；3.個舊市人民醫(yī)院，云南 個舊 661000）

雪上一枝蒿（Aconiturn brachypodum Diels）是毛茛科烏頭屬植物短柄烏頭的干燥塊根，一般認(rèn)為具有祛風(fēng)除濕、活血鎮(zhèn)痛之功效，為云南、貴州等中國西南地區(qū)民間外用藥之一，常用于治療風(fēng)濕疼痛、關(guān)節(jié)炎、跌打損傷等。現(xiàn)代化學(xué)成分和藥理活性研究表明，雪上一枝蒿的活性成分主要為烏頭堿，新烏頭堿，以及雪上一枝蒿甲素、乙素、丙素、丁素、庚素等多種生物堿[1-2]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、局部麻醉和抗腫瘤等多種藥理作用[3-4]。目前對于雪上一枝蒿的研究主要聚焦于生物堿，而對含量較高的多糖類成分研究較少，造成在雪上一枝蒿的提取過程中，多糖成分常常被當(dāng)作廢棄物棄用，導(dǎo)致珍貴藥材資源的浪費。本課題組長期專注雪上一枝蒿的現(xiàn)代研究，以產(chǎn)自云南東川的雪上一枝蒿作為藥物原材料，經(jīng)提取和分離純化得到1種多糖組分XP-10，免疫活性檢測結(jié)果顯示，雪上一枝蒿多糖組分XP-10具有顯著的免疫增強作用，研究成果已取得中國發(fā)明專利（專利號：CN107936130B，雪上一枝蒿多糖及提取方法以及應(yīng)用）。基于此，本研究通過分別構(gòu)建體外小鼠脾淋巴細(xì)胞模型、體內(nèi)免疫抑制小鼠模型，進一步研究雪上一枝蒿多糖組分XP-10的體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)作用，并初步探索其藥理機制，為雪上一枝蒿多糖的應(yīng)用和合理開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 BALB/c小鼠，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK2017-0004。飼養(yǎng)條件：SPF級動物房，恒溫（22±1）℃，恒濕（55±5）%，飼料、飲水均消毒，自由攝取。實驗動物進行1周以上適應(yīng)性飼養(yǎng)后使用。嚴(yán)格按照實驗動物相關(guān)管理條例進行所有動物實驗。實驗方案通過云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（SD2022-014）。

化合物雪上一枝蒿多糖XP-10性狀：焦糖色固體，純度＞75%，易溶于水，具有粘性，由云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院左愛學(xué)博士提供。

PE-Cy7-anti-mCD4（cloneGK.1.5）、Alexa FluorTM488-conjugated rat anti-mFoxp3（clone 150 D）和 Anti-CD3抗體均購自美國Biolegend公司；注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）購自江蘇盛迪醫(yī)療有限公司。干擾素 γ（interferon gamma，IFN-γ）、白介素2（interleukin-2，IL-2）和白介素 6（interleukin-6，IL-6）的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自美國invitrogen公司。除噻唑蘭（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）購自美國 Sigma公司外，其余均為國產(chǎn)分析試劑。

1.2 主要儀器 3111二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo-fisher，美國）、SpectraMax i3X 酶標(biāo)儀（MD，美國）、CantoII流式細(xì)胞儀（BD，美國）。

2 方法

2.1 制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液 正常小鼠采用酒精消毒后，無菌狀態(tài)下取其脾臟，載玻片輕輕研磨脾，而后濾膜過濾，離心（1 200 rpm，4 ℃，5 min），棄上清，使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，加入RPMI-1640終止裂解，PBS洗2次，最后加入10% RPMI-1640培養(yǎng)基，并將脾淋巴細(xì)胞濃度調(diào)至4×106個/mL，備用。

2.2 體外ConA、LPS、Anti-CD3分別誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖 將制備好的正常小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，然后加入50 μL不同濃度的 XP-10 和 50 μL 絲裂原 ConA（2.5 μg/mL）、LPS（10 μg/mL）或 Anti-CD3（5 μg/mL）抗體，每個濃度梯度設(shè)3個復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液20 μL/孔，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出96孔板，4℃低溫離心10 min，3 000 rpm，小心吸棄上清，加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL/孔，振蕩器震蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，使用酶標(biāo)儀檢測各孔570 nm處的吸光度OD值。計算：細(xì)胞活力增加率=（OD給藥組-OD對照組）/OD對照組×100%。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞因子的產(chǎn)生 常規(guī)制備正常小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為2×106個/mL，將1 mL脾淋巴細(xì)胞與1 mL ConA共接種于24孔板上，另設(shè)無刺激的對照組，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束，收集培養(yǎng)上清，-80℃凍存。細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6濃度采用ELISA法檢測，檢測方法參照試劑盒產(chǎn)品說明書。

2.4 構(gòu)建體內(nèi)免疫抑制小鼠模型、分組及給藥 同批次飼養(yǎng)的BALB/c小鼠20只，體質(zhì)量約18 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按照文獻(xiàn)方法[5]誘導(dǎo)體內(nèi)免疫抑制模型（正常組除外）。具體方法如下：模型小鼠在第1天和第4天注射CTX（80 mg/kg），在第1次注射CTX 2 h后，隨機分為模型組、XP-10低劑量組（125 mg/kg）、中劑量組（250 mg/kg）和高劑量組（500 mg/kg），另設(shè)正常對照組。低、中高劑量分別以125 mg/kg、250 mg/kg和500 mg/kg劑量灌胃XP-10，連續(xù)給藥8 d。模型組和正常對照組灌胃等體積的生理鹽水。每天分別觀察各組小鼠的生存狀態(tài)并記錄小鼠體質(zhì)量，在末次給藥后對所有小鼠進行處理。

2.5 檢測體內(nèi)免疫抑制小鼠模型相關(guān)指標(biāo) 末次給藥后稱量各小鼠體質(zhì)量，處理小鼠后，取出小鼠的脾臟和胸腺，于無菌條件下稱量。記重后常規(guī)制備各組小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為4×106個/mL。用于MTT脾淋巴細(xì)胞活力和流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.5.1 MTT法脾淋巴細(xì)胞活力 將制備好的各組脾淋巴細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，然后加入 100 μL 絲裂原 ConA（2.5 μg/mL），每個濃度梯度設(shè)3個復(fù)孔，于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。MTT法檢測各組脾淋巴細(xì)胞的活力。具體方法見2.2。

2.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測 流式細(xì)胞術(shù)檢測具體方法[6-7]如下：各組分別取含1×106個脾淋巴細(xì)胞對應(yīng)毫升量的細(xì)胞懸液，1 200 rpm離心5 min，棄上清，封閉FcR，再加入帶熒光標(biāo)記的CD4抗體，室溫下放置15 min，洗液洗1遍，固定液固定30 min后，固定穿膜液洗2遍，2 000 rpm離心5 min，棄上清后，加入熒光標(biāo)記Foxp3抗體，孵育45 min，加入流式buffer，離心，采用Flowjo軟件進行分析。

2.6 處理數(shù)據(jù) 采用SPSS進行數(shù)據(jù)分析處理，組間差異使用One-Way ANOVA單因素方差分析；若方差不齊，采用LSD法分析。所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 XP-10體外干預(yù)能顯著促進淋巴細(xì)胞的增殖刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）能分別特異性誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞增殖，因此常被分別用作評價T、B淋巴細(xì)胞功能的指標(biāo)。anti-CD3抗體與CD3結(jié)合，能夠誘導(dǎo)IL-2受體鏈（CD25）與IL-2受體結(jié)合組成高親和力受體，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生克隆性增殖。為研究雪上一枝蒿多糖組分XP-10的體外免疫效應(yīng)，我們分別構(gòu)建了ConA、LPS和anti-CD3抗體誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖模型，并使用不同濃度的XP-10進行干預(yù)。XP-10在無任何刺激的狀態(tài)下，呈濃度依賴性促進淋巴細(xì)胞增殖，提示XP-10具有絲裂原樣活性。在ConA、LPS誘導(dǎo)的增殖細(xì)胞模型中，XP-10能顯著促進T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性。另外，XP-10在250 μg/mL濃度下可促進anti-CD3抗體誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果見圖1。

圖1 XP-10體外對淋巴細(xì)胞增殖功能的影響

3.2 XP-10體外干預(yù)能提高淋巴細(xì)胞分泌上清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6的水平 如上之體外淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，XP-10體外具有促進淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)。為進一步研究XP-10對細(xì)胞因子的調(diào)控作用，初步揭示其增強免疫的機制，采用ELISA法檢測XP-10對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子水平的影響。結(jié)果如表1所示：在Con A誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中，與對照組比較，XP-10能顯著促進脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6水平；與之相反，細(xì)胞因子IL-2的表達(dá)水平低于陽性對照組。

表1 XP-10對Con A誘導(dǎo)的正常脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的影響（±s，n=3）

表1 XP-10對Con A誘導(dǎo)的正常脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

IL-6（pg/mL）陰性對照組 - 400±11 570±42 182±3陽性對照組 - 540±80 1217±53 360±65 XP-10 2.5 903±178 957±51** 658±123*5 1031±141*929±66** 780±121*10 1214±162*1169±381 889±4**20 1091±189*854±87** 894±56**組別 濃度（μg/mL）IFN-γ（pg/mL）IL-2（pg/mL）

3.3 XP-10對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠器官指數(shù)和增殖的影響 為更好地測定XP-10口服灌胃的體內(nèi)免疫增強作用，我們通過二次腹腔注射CTX，成功構(gòu)建體內(nèi)免疫抑制小鼠模型。與正常組相比，免疫抑制模型組小鼠的體質(zhì)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低。結(jié)果顯示：使用XP-10進行灌胃干預(yù)能顯著提高免疫抑制模型小鼠的免疫功能，小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所提升，其中以XP-10低劑量組（125 mg/kg）治療效果尤為顯著，差異具有顯著性（P＜0.05）。MTT法檢測淋巴細(xì)胞活性結(jié)果顯示：XP-10低劑量（125 mg/kg）體外灌胃干預(yù)，對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的活性具有顯著促進作用（P＜0.05）。見圖2。

圖2 XP-10對免疫抑制模型小鼠器官指數(shù)和增殖的影響

3.4 XP-10能夠顯著下調(diào)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠Treg細(xì)胞的表達(dá)水平 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）與機體抗腫瘤免疫應(yīng)答密切相關(guān)，為進一步揭示XP-10誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的機制，我們進一步檢測了免疫抑制模型小鼠Treg細(xì)胞的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，XP-10低劑量（125 mg/kg）體內(nèi)灌胃干預(yù)后，免疫抑制模型小鼠Treg細(xì)胞（CD4+Foxp3+T細(xì)胞）的表達(dá)比例顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 XP-10對免疫抑制模型小鼠Treg表達(dá)的影響

4 討論

腫瘤免疫治療主要是通過調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤的現(xiàn)代生物免疫治療所靶向的是人體免疫系統(tǒng)而非直接針對腫瘤，這種從宏觀出發(fā)的治療思路與中醫(yī)學(xué)的整體治療觀念高度契合。中醫(yī)藥在腫瘤的綜合防治方面有著獨特優(yōu)勢，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“邪之所湊，其氣必虛”是腫瘤的基本病機，“扶正固本”“養(yǎng)正積自除”是治療腫瘤的基本原則和方法，通過調(diào)整臟腑氣血陰陽，增強人體正氣所具的抗病能力以使“正勝邪卻”，亦即“正氣存內(nèi)，邪不可干”。扶正療法在中醫(yī)學(xué)腫瘤防治中具有重要意義，貫穿了腫瘤治療的全過程，大量現(xiàn)代科學(xué)研究也已證明扶正治療可以調(diào)控細(xì)胞免疫功能[8]。隨著生命科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷交叉滲透，扶正療法、免疫療法兩者可以有機結(jié)合造福患者。探索開發(fā)具有免疫治療效用的中藥材及其有效成分潛力巨大。研究中藥雪上一枝蒿多糖在抗腫瘤免疫方面的作用機制，可在一定程度上豐富腫瘤的中醫(yī)證候、治法方藥等方面的理論依據(jù)與科學(xué)證據(jù)。

多糖是生命體內(nèi)廣泛存在且具有多種生物活性的一類天然大分子物質(zhì)，其對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用一直是科學(xué)家研究的熱點之一。越來越多的研究表明，天然來源的植物多糖可通過與免疫細(xì)胞的不同受體結(jié)合、誘導(dǎo)機體不同的細(xì)胞信號，從而調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，包括細(xì)胞免疫、體液免疫、補體系統(tǒng)等，主要作用的免疫效應(yīng)包括：刺激T/B淋巴細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子、提高自然殺傷細(xì)胞殺傷活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放等[9]。在中藥研究早期，多糖活性成分常常作為沒有活性的雜質(zhì)被去除。1972年日本科學(xué)家在對香菇多糖研究中發(fā)現(xiàn)植物多糖是具有免疫調(diào)節(jié)活性的，此后，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多糖就被作為抗腫瘤的免疫的輔助用藥迅速而廣泛地應(yīng)用于臨床。隨著植物多糖研究的不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)黃芪多糖、人參多糖等多種植物多糖均具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，能提高機體巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等的免疫活性[10-11]，在科研和臨床應(yīng)用中均發(fā)現(xiàn)其具有非常好的提高免疫力、抗抗腫瘤等效果。綜上所述，植物多糖作為植物的重要活性成分之一，對免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用，是臨床開發(fā)抗腫瘤免疫輔助用藥的重要來源之一。

本課題組前期聚焦云南東川產(chǎn)雪上一枝蒿，經(jīng)提取、分離得到多糖組分XP-10，并成功申獲專利。在此基礎(chǔ)上，本研究在體外系統(tǒng)評價XP-10對ConA、LPS或anti-CD3抗體誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖功能的影響，發(fā)現(xiàn)XP-10不僅具有絲裂原樣活性，而且在ConA、LPS誘導(dǎo)的增殖細(xì)胞模型中，XP-10能夠顯著促進T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性。XP-10在250 μg/mL濃度下可促進anti-CD3抗體誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。以上結(jié)果提示，雪上一枝蒿多糖組分XP-10在體外具有較好的免疫增強活性，可能在抗腫瘤免疫方面具有較好的應(yīng)用前景。

IL-2、IFN-γ是T淋巴細(xì)胞激活后所產(chǎn)生的兩種重要細(xì)胞因子，兩者具有很強的促進、擴大免疫效應(yīng)的功能。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在免疫和炎癥反應(yīng)中具有重要作用，是機體重要的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子。為進一步研究XP-10對細(xì)胞因子的影響，初步揭示其誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化的機制，我們采用ELISA法檢測IFN-γ、IL-2和IL-6水平。結(jié)果表明，XP-10藥物體外干預(yù)能顯著提高脾淋巴細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6水平，然而對IL-2產(chǎn)生無明顯的影響。由于IL-2能引起多種淋巴細(xì)胞（如T、B細(xì)胞及NK細(xì)胞等）的增殖，淋巴細(xì)胞在增殖過程中，需要消耗大量的IL-2，故推測由于XP-10能顯著促進淋巴細(xì)胞增殖，從而需要損耗大量的IL-2，因此導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖24 h后，細(xì)胞因子IL-2無明顯變化。

一般來說，當(dāng)機體免疫系統(tǒng)受到損害時，對抗原的應(yīng)答能力一定程度上會有所下降，此時所表現(xiàn)出的這種免疫異常狀態(tài)即免疫抑制。對于免疫抑制模型，環(huán)磷酰胺、氫化可的松、環(huán)孢菌素A、地塞米松等是目前較為常用的化學(xué)造模試劑。環(huán)磷酰胺是臨床常用的化療藥物之一，能夠真實模擬化療誘導(dǎo)體內(nèi)免疫抑制異常狀態(tài)而應(yīng)用最廣[12]。它的主要機制是通過其代謝產(chǎn)物破壞DNA分子，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)較強免疫抑制效應(yīng)，因此常用于評價體內(nèi)給藥對細(xì)胞免疫和體液免疫影響的疾病模型。結(jié)果顯示，雪上一枝蒿多糖XP-10干預(yù)后，顯著提高了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型小鼠的免疫功能，包括對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的模型小鼠體質(zhì)量的提升，對免疫抑制模型小鼠脾和胸腺指數(shù)的提高，促進ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖功能，然而其提高機體免疫功能并不呈劑量依賴性，以XP-10低劑量（125 mg/kg）效果尤佳。分析原因可能如下：（1）多糖組分純度不太高，可能混有其他成分，從而抵消了多糖的免疫增強效應(yīng)；（2）文獻(xiàn)報道很多免疫增強藥物體內(nèi)給藥量效關(guān)系不明確，且其確切的機制尚不明確。

T細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)最重要的細(xì)胞類群，與抗腫瘤免疫過程密切相關(guān)。Treg細(xì)胞是一類具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的淋巴細(xì)胞亞群，是抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要抑制性細(xì)胞，其表達(dá)程度與臨床不良預(yù)后密切相關(guān)，微環(huán)境中Treg細(xì)胞能夠通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的殺腫瘤作用，減弱機體抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而促進腫瘤的生長[13]。因此，靶向Treg細(xì)胞，減少Treg細(xì)胞數(shù)量，提高機體抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)是治療腫瘤的有效方法。本研究結(jié)果顯示，XP-10（125 mg/kg）藥物干預(yù)后，Treg細(xì)胞（CD4+Foxp3+T細(xì)胞）比例顯著下降，提示XP-10可通過減少Treg細(xì)胞數(shù)量而增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，可能在對抗化療藥物副作用和抗腫瘤免疫輔助用藥方面具有一定的應(yīng)用前景。