慢性心力衰竭患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達與炎性因子和左心室重構的關系

蘇布道,梁戎,靈小,蘇日娜

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是臨床常見的一種由心臟結構或功能異常導致的射血功能受損或心室充盈的臨床綜合征,近年來隨著人口老齡化的持續發展和各種心血管疾病患者生存期的延長,CHF發生率逐年上升,給我國造成了巨大的公共衛生負擔[1-3]。左心室重構(left ventricular remodeling,LVR)是心力衰竭發生發展的病理基礎,炎性反應在LVR中發揮重要作用[4-5]。尋找可反映CHF炎性反應和LVR的生物標志物對改善患者預后至關重要。研究表明,外泌體非編碼RNA能通過調控炎性反應和LVR等參與心力衰竭發生發展[6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)H19是最先被發現的LncRNA之一,LncRNA H19能促進心肌細胞炎性反應[7]。微小RNA(microRNA,miRNA)-214是一種廣泛保守的miRNA,研究報道miR-214能抑制心肌細胞炎性反應[8]。現分析CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達與炎性因子和左心室重構的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年7月—2022年9月內蒙古自治區人民醫院心血管內科收治CHF患者120例為CHF組,其中男46例,女74例,年齡43～87(60.93±9.03)歲;病程3～17(10.54±2.64)年;紐約心臟病協會(New York Heart Association,NYHA)心功能分級[9]:Ⅱ級44例,Ⅲ級40例,Ⅳ級36例;誘發疾病:冠心病54例,擴張型心肌病21例,原發性高血壓45例;合并癥:慢性腎臟病14例,慢性阻塞性肺疾病11例,糖尿病9例,中樞性睡眠呼吸暫停16例。另選取同期醫院體檢健康志愿者40例為健康對照組,其中男15例,女25例,年齡39～76(61.52±8.44)歲。2組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(2020-02-0321),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合《慢性心力衰竭基層診療指南(2019年)》[10]中CHF診斷標準;②年齡≥18歲。(2)排除標準:①急性心力衰竭;②先天性心臟疾病;③妊娠及哺乳期婦女;④造血、免疫、神經系統損害;⑤合并嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血漿外泌體LncRNA H19、miR-214基因表達檢測:使用枸櫞酸鈉采血管收集受試人員空腹靜脈血3 ml,離心留取血漿置于離心管,再次離心收集上清液保存于離心管,放置于-80℃冰箱凍存。室溫下解凍血漿取1 ml至離心管,經緩沖液XBP、XWP、XE 350加入和離心后,孵育再離心收集洗脫液。透射電子顯微鏡(日立高新技術公司,型號:HT7800)觀察分離所得血漿外泌體(直徑為30～150 nm類圓形雙層膜囊泡)。取血漿外泌體200 μl,Trizol試劑盒(賽默飛世爾科技公司)提取血清總RNA,鑒定純度、濃度合格后,Takara反轉錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)合成cDNA,反應條件:37℃ 1 h、80℃ 5 s。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應,反應體系共20 μl:cDNA 1 μl、上下游引物各0.5 μl、Universal miRNA qPCR primer 0.5 μl、2×TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μl、無核酸酶水7.5 μl;反應條件:95℃ 90 s(1次),95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(循環40次)。LncRNA H19以GAPDH為內參,miR-214以U6為內參,2-ΔΔCT法計算血漿外泌體LncRNA H19、miR-214相對表達量。LncRNA H19正向引物:5′-TCCCAGAACCCACAACATGAA-3′,反向引物:5′-TTCACCTTCCAGAGCCGATTC-3′;GAPDH正向引物:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′,反向引物:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′;miR-214正向引物:5′-CGTGTGCAAATCCATGCAA-3′,反向引物:5′-CGTGTGCAAATCCATGCAA-3′;U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 血清炎性因子檢測:患者入院翌日晨和健康對照組體檢時采集空腹肘靜脈血3 ml,離心留取上層血清,采用酶聯免疫吸附法(武漢純度生物科技有限公司)檢測白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.3.3 超聲心動圖檢查:研究對象均采用M型彩色多普勒超聲診斷儀(荷蘭飛利浦,型號:EPIQ7)行超聲心動圖檢查,參考《超聲心動圖評估心臟收縮和舒張功能臨床應用指南》[11]通過雙平面法(改良Simpson)檢測左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)、舒張末期室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST),使用體表面積校正左心室質量計算左心室心肌質量指數(left ventricular myocardial mass index, LVMI)。

2 結 果

2.1 2組血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達比較 CHF組血漿外泌體LncRNA H19表達高于健康對照組,miR-214表達低于健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組與CHF組血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達比較

2.2 不同NYHA心功能分級CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達比較 NYHA心功能分級Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級CHF患者血漿外泌體LncRNA H19表達依次升高,miR-214表達依次降低(P<0.01),見表2。

表2 不同NYHA心功能分級CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達比較

2.3 2組血清炎性因子和左心室重構指標比較 CHF組血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平高于健康對照組(P<0.01),見表3。CHF組LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI高于健康對照組(P<0.01),見表4。

表3 健康對照組與CHF組血清炎性因子水平比較

表4 健康對照組與CHF組左心室重構指標比較

2.4 不同NYHA心功能分級CHF患者血清炎性因子和左心室重構指標比較 NYHA心功能分級Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級CHF患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平依次升高(P<0.01),見表5。NYHA心功能分級Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級CHF患者LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI依次升高(P<0.01),見表6。

表5 不同NYHA心功能分級CHF患者血清炎性因子水平比較

表6 不同NYHA心功能分級CHF患者左心室重構指標比較

2.5 CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達與炎性因子、NYHA心功能分級和左心室重構指標的相關性 經StarBase數據庫https://starbase.sysu.edu.cn/預測,LncRNA H19與miR-214存在互補序列,見圖1。Pearson/Spearman相關性分析顯示,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NYHA心功能分級、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈正相關,與miR-214呈負相關(P<0.01);miR-214與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NYHA心功能分級、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈負相關(P<0.01),見表7。

圖1 LncRNA H19與miR-214互補序列示意圖

表7 CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達與NYHA心功能分級、炎性因子和左心室重構指標的相關性

2.6 血漿外泌體LncRNA H19、miR-214預測CHF患者發生左心室重構的效能 繪制血漿LncRNA H19、miR-214預測CHF患者發生左心室重構的ROC曲線,并計算AUC。結果顯示,血漿外泌體LncRNA H19、miR-214及二者聯合預測左心室重構的AUC分別為0.780、0.779、0.877,二者聯合的AUC高于單項預測(Z=3.026、3.114,P=0.003、0.002),見表8、圖2。

圖2 LncRNA H19、miR-214預測CHF患者發生左心室重構的ROC曲線

表8 LncRNA H19、miR-214預測CHF患者發生左心室重構的效能比較

3 討 論

CHF是所有心血管疾病的必然終點,主要因原發性心肌損害和異常引起,盡管近年來在其預防、診療和綜合管理等領域取得較大進展,心臟再同步治療等治療技術和“新四聯”藥物被應用于CHF治療,但CHF再住院率和病死率仍然居高不下[12-13]。目前臨床已普遍使用B型鈉尿肽或N末端B型利鈉肽前體診斷CHF和評估其病情、預后,但二者易受到性別、年齡、肥胖、腎功能、藥物、貧血等多種因素影響[14],還需尋找新的生物標志物。

左心室重構是CHF發生發展和決定病情、預后的病理基礎,其過程涉及炎性反應、氧化應激、細胞凋亡、細胞纖維化等諸多機制,炎性反應能通過促進心肌細胞凋亡促進左心室重構[4-5]。IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α是臨床常用的炎性因子指標。目前臨床主要通過超聲心動圖評估左心室重構,左心室重構后表現為LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI升高[4,11]。本研究結果顯示,與健康對照組比較,CHF組血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平和LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI升高,說明CHF患者存在明顯的炎性反應和左心室重構,符合CHF患者病理變化。結果還顯示,NYHA心功能分級Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級CHF患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平和LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI依次升高,說明CHF患者隨著病情加重,炎性反應和左心室重構會進一步加重。

外泌體是來源于多種細胞的一種直徑30～150 nm的囊泡,能通過運載脂質、蛋白質、非編碼RNA等物質傳遞細胞和組織間的信息,其內攜帶的多種遺傳物質能通過自分泌和旁分泌途徑被細胞、組織、器官吸收,參與多種病理生理過程[15]。近年研究表明,非編碼RNA能通過調控炎性反應、氧化應激、細胞凋亡、細胞纖維化等諸多機制參與左心室重構過程[16]。LncRNA H19是最早被證實的腫瘤相關LncRNA[17]。近年研究發現,LncRNA H19還參與其他疾病過程,Wang等[18]研究報道,LncRNA H19在心肌細胞代謝紊亂中發揮至關重要的作用,與心臟功能密切相關。Luo等[19]研究報道,敲低或抑制LncRNA H19能減少心肌細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達,抑制心肌細胞缺血/再灌注后炎性反應和凋亡。Tang等[20]研究報道,抑制LncRNA H19能減少糖尿病大鼠心肌細胞炎性反應和凋亡,促進大鼠心功能改善。上述研究表明,LncRNA H19與心肌細胞炎性反應和凋亡密切相關。本研究結果顯示,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19表達上調,并隨著NYHA心功能分級增加而上調,說明血漿外泌體LncRNA H19表達上調參與CHF發生發展。結果還顯示,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈正相關,說明血漿外泌體LncRNA H19高表達與CHF炎性反應和左心室重構有關。最近Choong等[21]研究也報道,下調LncRNA H19能抑制小鼠心肌梗死后左心室重構。

miR-214是一種骨代謝關鍵調控的miRNA[22]。近年研究發現,miR-214還參與其他疾病過程,陳貽人等[23]研究報道,上調miR-214表達能抑制脂多糖誘導的IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax表達,抑制心肌細胞炎性反應和凋亡。Lan等[24]研究報道,上調miR-214表達能抑制缺氧誘導的IL-1β、IL-6、TNF-α和丙二醛、超氧化物歧化酶表達,抑制心肌細胞炎性反應和氧化應激,改善心肌細胞損傷。上述研究表明,miR-214能通過抑制炎性反應改善心肌損傷。同時Gholaminejad等[25]通過基因集富集分析發現,miR-214在心力衰竭中差異表達,可能是心力衰竭新的標志物。本研究結果顯示,CHF患者血漿外泌體miR-214表達下調,并隨著NYHA心功能分級增加而下調,說明血漿外泌體miR-214表達下調參與CHF發生發展。結果還顯示,CHF患者血漿外泌體miR-214與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈負相關,說明血漿外泌體miR-214低表達與CHF炎性反應和左心室重構有關。Du等[26]實驗也報道,上調miR-214能抑制心肌梗死后左心室重構。

研究表明,LncRNA能通過海綿miRNA調控相關病理過程[27]。筆者通過StarBase數據庫預測發現,LncRNA H19與miR-214存在互補序列,相關性分析也發現,LncRNA H19與miR-214在CHF患者血漿外泌體中表達呈負相關,提示LncRNA H19與miR-214可能共同通過炎性反應和左心室重構參與CHF過程。張苡榕等[28]研究也顯示,沉默LncRNA H19能靶向上調miR-214,抑制心肌細胞炎性反應和凋亡,改善心肌損傷。最后本研究通過繪制ROC曲線分析外泌體LncRNA H19、miR-214表達對CHF患者發生左心室重構的效能發現,血漿LncRNA H19、miR-214及二者聯合預測左心室重構的AUC分別為0.780、0.779、0.877,二項聯合的AUC最大,這說明血漿外泌體LncRNA H19、miR-214可能成為CHF患者左心室重構的評估指標,且二者聯合檢測能提升其評估價值。

綜上所述,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19表達升高,miR-214表達降低,二者可能共同影響CHF患者病情嚴重程度、炎性反應和左心室重構。但本研究結果仍需多中心研究驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

蘇布道:設計研究方案,收集整理數據,論文撰寫;梁戎:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;靈小:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;蘇日娜:收集數據,進行統計學分析,論文修訂