過表達CTRP6通過調控Nrf2/HO-1通路在減輕糖尿病小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用

沈倩妮,王蘇,劉恒娟,李亞男,龔平

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)作為目前缺血性腦卒中的主要防治焦點,其發病機制復雜多樣[1]。而伴有糖尿病的患者由于其抗氧化、抗炎能力降低,導致血管脆性增加,更易誘發腦損傷[2]。因此,積極尋找新的治療方案以減輕糖尿病患者CIRI帶來的負擔具有重要意義。C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白-6(C1q/tumor necrosis factor related protein 6,CTRP6)作為CTRP家族的成員,與多種疾病的發生進展密切相關[3]。研究證實,CTRP6可防止多柔比星引起的心臟損傷并激活蛋白激酶B(PKB/AKT)通路[4]。然而CTRP6是否可以通過調控核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)通路進而改善糖尿病小鼠CIRI目前尚未見相關報道。本研究旨在探討CTRP6調控的Nrf2/HO-1通路在糖尿病小鼠CIRI中的作用,以期為改善糖尿病患者CIRI的預后提供新思路,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物及分組:清潔級健康雄性C57BL/6小鼠18只,9～10周齡,體質量(23±2)g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,飼養于武漢大學動物試驗中心SPF環境,給予12 h/12 h光/暗條件(燈亮時間為07:00),濕度(65±5)%,溫度(25±1)℃,常規喂養顆粒飼料。隨機數字表法分為假手術組(Sham)、腦缺血再灌注組(IR)、腦缺血再灌注+CTRP6過表達組(IR+CTRP6),各6只。(2)主要試劑:STZ、TTC購自美國Sigma公司,腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)-CTRP6購自上海Hanbio公司,Nrf2、HO-1、NQO-1、NF-κB、p-NF-κB、IKK、p-IKK抗體購自英國Abcam公司,SOD、CAT、MDA試劑盒購自南京建成公司,IL-1β、TNF-α、MCP-1試劑盒購自美國賽默飛公司,Caspase-3試劑盒購自美國Biovision公司,Caspase-9試劑盒購自上海生工生物公司,ApopTag Plus凋亡熒光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法 2021年9月—2022年6月于武漢大學人民醫院進行實驗。小鼠糖尿病模型建立:小鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg,連續5 d,而后檢測其空腹血糖,空腹血糖大于13.9 mmol/L時認為糖尿病模型制備成功。參照文獻[5-7],IR+CTRP6組小鼠予STZ后3周接受AAV-CTRP6腦室注射,再過3周后參照文獻[8]建立大腦中動脈阻斷(MCAO)模型。麻醉小鼠后于頸部正中切口,分離左頸總動脈和頸外動脈,結扎頸總動脈近心端及頸外動脈,夾閉頸總動脈遠心端,在靠近頸總動脈結扎處插入線栓至稍感阻力后停止,固定線栓并縫合。線栓置入60 min后拔出并恢復灌注。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 小鼠腦梗死面積檢測:MCAO后24 h處死小鼠,收集大腦組織并沿冠狀位切片(厚度約2 mm)。切片用TTC在37℃水浴箱中孵育30 min,10%福爾馬林固定過夜。次日掃描并用Image J軟件進行分析。

1.3.2 Western-blot檢測Nrf2、NF-κB通路相關蛋白:在含有蛋白酶抑制劑顆粒的RIPA裂解緩沖液中加入腦組織,8%～12%的SDS-PAGE電泳凝膠上分離并轉移到PVDF膜上。隨后室溫下5%脫脂牛奶-PBS阻斷2 h,并加入Nrf2、HO-1、NQO-1、NF-κB、p-NF-κB、p-IKK、IKK抗體(1∶1 000),4℃下孵育過夜。次日用相應的含HRP的二抗和增強化學發光劑再次孵育,Image J對印跡條帶進行量化。

1.3.3 氧化應激及炎性因子檢測:取腦組織用預冷的PBS漂洗去除血液,濾紙吸干稱重,按比例配置組織勻漿液,離心后取上清置于冰上待測。WST-1法檢測SOD,可見光法檢測CAT,TBA法檢測MDA,ELISA法檢測IL-1β、TNF-α、MCP-1水平,嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.4 Caspase活性及TUNEL染色檢測:使用Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒對Caspase活性進行檢測,操作步驟嚴格按說明書進行。根據說明書采用ApopTag Plus原位凋亡熒光素檢測試劑盒進行染色,在熒光顯微鏡下觀察并通過Image-Pro Plus軟件分析TUNEL陽性細胞數。

2 結 果

2.1 各組小鼠CIRI后腦梗死面積及相關信號通路表達比較 與Sham組比較,IR組Nrf2/HO-1通路及其下游NQO-1蛋白表達降低,p-NF-κB/NF-κB與p-IKK/IKK水平升高(P<0.01);與IR組比較,IR+CTRP6組腦梗死面積減少,Nrf2/HO-1通路及其下游NQO-1蛋白表達升高,p-NF-κB/NF-κB與p-IKK/IKK降低(P<0.01),見表1。

表1 各組小鼠腦梗死面積與Nrf2、NF-κB通路相關蛋白表達比較

2.2 各組小鼠CIRI后氧化應激及炎性因子表達比較 與Sham組比較,IR組SOD、CAT活性降低,MDA含量、IL-1β、TNF-α、MCP-1表達水平升高(P<0.01);與IR組比較,IR+CTRP6組SOD、CAT活性升高,MDA含量、IL-1β、TNF-α、MCP-1表達水平降低(P<0.01),見表2。

表2 各組小鼠氧化應激及炎性因子水平比較

2.3 各組小鼠CIRI后凋亡因子及細胞凋亡表達比較 與Sham組比較,IR組Caspase-3、Caspase-9活性升高,TUNEL陽性細胞數增多(P<0.01);與IR組比較,IR+CTRP6組Caspase-3、Caspase-9活性降低,TUNEL陽性細胞數減少(P<0.01),見表3。

表3 各組小鼠凋亡因子及細胞凋亡比較

3 討 論

大量證據表明,氧化應激是誘發缺血性腦卒中的重要機制之一,再灌注后氧自由基增多會對細胞造成直接損害,而機體內氧化和抗氧化系統的失衡又可導致多種信號通路的激活[9]。糖尿病患者中過多的活性氧(ROS)可進一步誘發脂質過氧化、蛋白質變性和DNA損傷等,同時ROS還可引發后續的瀑布樣炎性反應[10]。以上研究表明ROS的產生和炎性介質的累積可觸發神經損傷。

研究證實,CTRP6參與了心腦血管代謝疾病的發生進展,亦與胰島素抵抗和糖尿病密切關聯[11]。另有研究認為,CTRP6能對急性刺激做出反應并在營養過剩的情況下發揮作用,通過誘發“生理性炎性反應”以限制脂肪組織擴張[12]。本研究發現再灌注后小鼠腦梗死面積增大,當補充CTRP6后小鼠梗死面積降低。因此進一步探討CTRP6在CIRI中的具體機制及其與氧化應激和炎性反應的關系,對預防CIRI有重要價值。

Nrf2/HO-1通路作為機體內源性的保護機制,被認為是對抗氧化應激的主要細胞防御手段[13]。本研究發現在糖尿病CIRI后Nrf2/HO-1通路及其下游的NQO-1表達下降,而調控炎性介質的NF-κB通路及其下游IKK的磷酸化升高,表明再灌注損傷會導致腦組織中氧化應激和炎性反應的升高。新近研究發現,Nrf2和NF-κB之間存在分子串擾現象,在一定程度上可使細胞更精細地調節其對應激的反應,而Nrf2與NF-κB的失衡則會導致多種疾病的發生[14]。當過表達CTRP6后Nrf2/HO-1通路及其下游分子表達增加,機體抗氧化能力增強,NF-κB通路及其下游IKK的磷酸化降低,機體促炎水平減弱。

在糖尿病狀態下,炎性因子作為與缺血性腦卒中密切相關的機制之一,可激活小膠質細胞并招募白細胞分泌細胞因子形成促炎微環境,進一步加劇糖尿病小鼠腦損傷[15]。本研究結果發現,再灌注后小鼠SOD、CAT活性降低,MDA含量升高,而IL-1β、TNF-α、MCP-1的表達增多。過表達CTRP6后氧化應激和炎性因子的積累明顯降低,證實CTRP6通過抑制氧化應激和炎性因子的表達在糖尿病CIRI中發揮保護作用。

凋亡作為決定卒中結局的關鍵因素,其可在腦缺血發生數分鐘后啟動,并在整個卒中過程中持續存在,抑制神經元的凋亡可有效減輕糖尿病小鼠腦缺血再灌注損傷[16]。研究顯示,CTRP6可減輕TNF-α誘導的唾液腺細胞凋亡以及IR損傷誘導的PC12細胞死亡[17-18]。研究發現,CTRP6可通過激活AKT信號通路保護心臟免受阿霉素(DOX)誘導的心肌凋亡[4]。與CTRP6在其他細胞類型中的抗凋亡作用相一致,本研究結果發現,CIRI后Caspase-3與Caspase-9活性升高,同時TUNEL陽性細胞增多,補充CTRP6可降低Caspase的活性,減少凋亡細胞數量。

綜上所述,在糖尿病CIRI期間Nrf2/HO-1通路抑制,NF-κB通路激活,進而導致氧化應激、炎性因子、細胞凋亡增加,而過表達CTRP6可顯著減輕腦損傷。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

沈倩妮、王蘇:實施研究過程,論文撰寫;劉恒娟:資料搜集整理;李亞男:分析數據;龔平:課題設計,論文審核