巨大側耳原生質體制備條件的優化

駢永茹 李婧怡 李勤奮 王歡 李玉 楊陽

摘 要：? 為優化巨大側耳原生質體的制備條件，該研究以兩株不同溫型的巨大側耳菌株PG46和PG79為材料，采用單因素和正交試驗方法對原生質體制備的菌絲體菌齡、穩滲劑種類、溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時間進行研究。結果表明：（1）在單因素實驗中，巨大側耳原生質體制備的適宜條件為菌齡5 d，溶壁酶濃度2.5%，0.6 mol·L-1甘露醇，32 ℃（PG46）或27～35 ℃（PG79）酶解4 h。（2）正交試驗驗證并優化了單因素實驗結果，組合2（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.5%，0.6 mol·L-1的甘露醇，32 ℃酶解4 h）可同時作為PG46和PG79原生質體制備的最適條件，原生質體產量分別為11.22×106 CFU·mL-1和7.28×106 CFU·mL-1。（3）F-test檢驗中，各因素對原生質體制備的影響程度依次為菌齡＞溶壁酶濃度＞酶解溫度＞酶解時間（PG46），菌齡＞酶解時間＞酶解溫度＞溶壁酶濃度（PG79）。綜上所述，兩株不同溫型巨大側耳菌株的原生質體制備條件基本一致，菌齡對兩菌株原生質體得率的影響程度最顯著。該研究結果可為后續巨大側耳的雜交育種、遺傳轉化、全基因組測序等工作奠定基礎，進一步推動巨大側耳分子遺傳學的發展。

關鍵詞： 巨大側耳， 不同溫型， 熱區， 原生質體產量， 制備條件

中圖分類號：? Q94

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1308-09

收稿日期：? 2022-11-10

基金項目：? 海南省自然科學基金（322QN365）； 中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（1630042022003， 1630042022020）。

第一作者： 駢永茹（1999-），碩士研究生，研究方向為食用菌遺傳育種，（E-mail）pianyongru@163.com。

通信作者：? 楊陽，博士，助理研究員，研究方向為食用菌種質資源評價和遺傳育種，（E-mail）yyjob1992@163.com。

Optimization of protoplast preparation conditions

of Pleurotus giganteus

PIAN Yongru1，2， LI Jingyi1，3， LI Qinfen1，3， WANG Huan4， LI Yu5， YANG Yang1，3*

（ 1. Key Laboratory of Low Carbon Green Agriculture in Tropical China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China， Environment

and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China; 2. Institute of Applied Mycology，

College of Plant Science Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China; 3. National Agricultural Experimental

Station for Agricultural Environment， Danzhou 571700， Hainan， China; 4. Changchun University of Chinese Medicine，

Changchun 130117， China; 5. Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and

Medicinal Fungi， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China ）

Abstract：? In order to obtain the optimal conditions for the protoplast preparation of Pleurotus giganteus， two strains， PG46 and PG79， with different temperature types， were selected as materials to study the effects of five factors （mycelial age， osmotic stabilizer type， lywallzyme concentration， enzymatic hydrolysis duration and enzymatic hydrolysis temperature） based on single factor and orthogonal experimental methods. The results were as follows： （1） In the single factor test， the optimal conditions for the protoplast preparation of P. giganteus were mycelial culture for 5 d， using 2.5% lywallzyme with 0.6 mol·L-1 mannitol， incubated for 4 h at 32 ℃ （PG46） or 27-35 ℃ （PG79）. （2） Orthogonal experiment verified and optimized the single factor test results. Combination 2 （mycelial age 5 d， lywallzyme concentration 2.5%， 0.6 mol·L-1 mannitol， incubated for 4 h at 32 ℃） could be used as the optimal condition for the protoplast preparation of PG46 and PG79 at the same time， and the protoplast yields were 11.22 × 106 CFU·mL-1 and 7.28 × 106 CFU·mL-1， respectively. （3） For F-test， the influence degree of various factor on the protoplast preparation were mycelial age>lywallzyme concentration>enzymatic hydrolysis temperature>enzymatic hydrolysis duration （PG46）， and mycelial age>enzymatic hydrolysis duration>enzymatic hydrolysis temperature>lywallzyme concentration （PG79）， respectively. In conclusion， the protoplast preparation conditions of the two P. giganteus strains with different temperature types were basically the same， and the effects of mycelial age on the protoplasts yield of the two strains were the most significant. The results can lay a foundation for further cross-breeding， genetic transformation， whole genome sequencing and promote the molecular genetics development of P. giganteus.

Key words： Pleurotus giganteus， different temperature types， tropics， protoplast yield， preparation condition

巨大側耳（Pleurotus giganteus），是國內開發的一種珍稀食用菌，其口感和風味獨特，有豬肚般的滑膩，因而具有商品名“豬肚菇”（董洪新等，2010；Karunarathna et al.， 2012）。巨大側耳營養豐富，富含多糖、蛋白質、粗纖維等營養物質，并且具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌、保護肝臟等多種藥用功效，深受消費者喜愛（Phan et al.， 2014；Paravamsivam et al.， 2016）。于海龍等（2021）

研究發現，巨大側耳環境適應性強、生物學轉化率高，并且適宜在溫度較高的夏季栽培，對調節食用菌市場供應和反季節栽培，特別是熱區食用菌生產具有重要意義。隨著栽培面積的不斷擴大，巨大側耳的遺傳育種工作尤為重要（吳碧君，2020）。原生質體是指完整細胞去除細胞壁后，裸露出的一個具有生理功能的圓球體，仍含有整套的遺傳信息，并且具有較好的生理活性，是食用菌分子遺傳學研究的良好材料（Muralidhar & Panda， 2000））。近年來，原生質體單核化技術，已成功應用到食用菌生理生化、菌種復壯、遺傳轉化、遺傳育種和全基因組測序等工作中（Dai et al.， 2017；Sugano et al.， 2017；Raman et al.， 2021；劉海娟，2021），極大地推進了食用菌研究的深入開展。因此，對巨大側耳原生質體制備進行系統研究，有助于進一步推進巨大側耳遺傳育種工作的開展。

目前，關于原生質體的制備在糙皮側耳（Peng et al.， 1993）、刺芹側耳（Obatake et al.， 2003）、黃白側耳（Mizoguchi et al.， 2006）、靈芝（李欽艷等，2016）、木耳（崔瑋潔等，2019）和雙孢蘑菇（李良敏等，2020）等多個食用菌物種中得到廣泛研究。崔瑋潔等（2019）研究發現，原生質體的制備屬于一種酶促反應過程，其影響因素十分復雜，不同菌株甚至同一菌株不同生理狀態下，其原生質體制備條件也不盡相同。蘇文英等（2020）發現菌齡是原生質體制備的重要因素，玉木耳菌株在不同菌齡下，其原生質體制備條件存在較大差異。彭智華等（2000）基于單一變量原則，對1株野生巨大側耳菌株的原生質體分離條件進行研究，發現原生質體產量會受到酶解液、穩滲劑、菌齡和pH的影響，并篩選到適宜的原生質體制備條件，但其制備率和再生率仍不高。鄒彰毅和鄧百萬（2020）、孫佳星等（2022）基于正交試驗和響應面法，進一步優化了單因素結果，分別獲得了姬松茸和玉木耳原生質體制備的最優條件，極大地提高了原生質體產量和質量。可見，原生質體的制備受到多種因素的影響，且各因素間的交互作用也十分重要。然而，關于巨大側耳原生質體制備的研究較少，各因素對原生質體產量的影響程度及各因素間的交互作用也尚不明確，在一定程度上限制了巨大側耳遺傳育種工作的快速發展。

因此，本研究以前期篩選到的兩株不同溫型的巨大側耳菌株為材料，采用單因素和正交試驗的方法，對巨大側耳原生質體制備中的菌絲體菌齡、溶壁酶濃度、穩滲劑種類、酶解溫度和時間共5個關鍵影響因子進行研究。以期明確兩株不同溫型巨大側耳菌株的原生質體制備條件及差異，針對性提高巨大側耳原生質體制備效率。本研究結果可為進一步開展巨大側耳的雜交育種、全基因組測序和品種改良等奠定良好基礎，進而有效推動巨大側耳遺傳育種工作的深入開展。

1 材料與方法

1.1 材料

兩株不同溫型的巨大側耳菌株，分別為高溫型菌株PG46和中溫型菌株PG79（表1）。菌種現保存于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所菌種保藏中心。

MYG液體培養基：麥芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，加水混勻后，定容至1 L。

再生培養基：麥芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，瓊脂20 g，0.6 mol·L-1甘露醇，加水混勻后，定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 原生質體制備 將活化好的菌絲體接入MYG液體培養基中，于轉速150 r·min-1、26 ℃恒溫暗培養7 d。無菌條件下，過濾菌絲體，并先后用無菌水和穩滲劑（0.6 mol·L-1的甘露醇）各沖洗2次。將菌絲體置于濾紙上吸干，并稱取300 mg左右放入1.5 mL離心管中，加入3倍體積的2.0%濃度的溶壁酶溶液（0.02 g溶壁酶，1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇）。輕攪混勻后放入30 ℃的恒溫金屬浴中，酶解4 h得到原生質體粗提液。用無菌脫脂棉過濾后，3 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液。用0.6 mol·L-1的甘露醇輕輕沖洗管壁2次，去除多余酶解液，加入1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇以懸浮沉淀，制成原生質體原液。

1.2.2 原生質體再生 用0.6 mol·L-1的穩滲劑，將原生質體原液稀釋不同倍數，并在血球計數板下計數。分別吸取200 μL各稀釋倍數的原生質體溶液，均勻涂布到再生培養基上，無菌水稀釋的原生質體作對照。將實驗組和對照組均置于26 ℃恒溫暗培養，每天觀察菌落再生情況。

1.2.3 單因素實驗 分別設置菌齡（3、5、7、9、11 d）、溶壁酶濃度（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、穩滲劑種類（甘露醇、山梨醇、蔗糖、硫酸鎂、氯化鉀）、酶解溫度（25、27、30、32、35、38 ℃）和酶解時間（2、3、4、5、6 h）共5個處理因素（崔瑋潔等，2019；蘇文英等，2020），每個實驗設置5次重復，統計各因素對不同溫型巨大側耳菌株原生質體產量的影響。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗基礎上，分別選取菌齡、溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時間為考察因素，以原生質體產量為響應值，組成4因素3水平的正交試驗（表2），以確定巨大側耳原生質體制備的最適條件。

2 結果與分析

2.1 原生質體的釋放

將兩菌株的菌絲體置于溶壁酶溶液中，在適宜溫度下進行酶解。每隔半小時取一次樣，置于血球計數板中，在顯微鏡下觀察原生質體的釋放情況。結果顯示，巨大側耳的原生質體釋放分為3個階段（圖1）：前期，少量原生質體從菌絲體尖端釋放；中期，部分菌絲體側壁破裂，原生質體從菌絲體側面釋放；后期，隨著酶解時間的延長，多數菌絲體細胞壁破裂，大量原生質體釋放出來。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 菌絲體菌齡對原生質體制備的影響 由圖2：A可知，巨大側耳的原生質體產量，隨著菌齡的增加，呈現先上升后下降的趨勢。在5 d時，PG46和PG79的原生質體產量均達到最高，分別為4.82×106 CFU·mL-1和2.74×106 CFU·mL-1，且與其他菌齡的產量差異顯著；菌齡超過5 d后，原生質體產量下降，特別是11 d時原生質體產量最低，且低于最開始3 d的產量，分別為0.62×106 CFU·mL-1和0.86×106 CFU·mL-1。綜上可知，兩菌株制備原生質體的菌絲體最適菌齡為5 d。

2.2.2 穩滲劑種類對原生質體制備的影響

由圖2：B可知，不同穩滲劑中，PG46的原生質體產量由高到低依次為甘露醇>山梨醇>蔗糖>硫酸鎂>氯化鉀，最高產量為2.74×106 CFU·mL-1，其中甘露醇、山梨醇和蔗糖三者中的原生質體產量無顯著差異，但均顯著高于硫酸鎂和氯化鉀；PG79的原生質體產量由高到低依次為蔗糖>甘露醇>山梨醇>氯化鉀>硫酸鎂，最高產量為1.88×106 CFU·mL-1，前三者產量無顯著差異，但均顯著高于硫酸鎂和氯化鉀。可見，穩滲劑類別對PG46和PG79的原生質體產量影響顯著，有機糖醇類穩滲劑甘露醇、山梨醇和蔗糖均為制備巨大側耳原生質體的適宜穩滲劑。

2.2.3 溶壁酶濃度對原生質體制備的影響

由圖2：C可知，隨著溶壁酶濃度的增加，PG46和PG79的原生質體產量先增加后降低。當溶壁酶濃度為2.5%時，兩菌株的原生質體產量均達到最高，分別為7.64×106 CFU·mL-1和7.38×106 CFU·mL-1；當濃度為3.0%時，原生質體產量下降且與2.5%濃度的原生質體產量具有顯著差異。可見，制備巨大側耳原生質體的最適溶壁酶濃度為2.5%。

2.2.4 酶解溫度對原生質體制備的影響 由圖2：D可知，隨著酶解溫度的升高，PG46和PG79的原生質體產量呈現先增加后降低的趨勢。當酶解溫度為32 ℃時，PG46的原生質體產量達到最高，為6.22×106 CFU·mL-1，且與其他酶解溫度差異顯著；PG79的原生質體產量也在32 ℃時達到最高，為3.54 ×106 CFU·mL-1，但與27、30、35 ℃的原生質體產量無顯著差異。綜上可見，PG46原生質體制備的最適酶解溫度為32 ℃，PG79原生質體制備的適宜酶解溫度較廣，為27～35 ℃。

2.2.5 酶解時間對原生質體制備的影響

由圖2：E可知，PG46和PG79的原生質體產量，隨酶解時間的增加呈先上升后下降的趨勢。當酶解時間為4 h時，兩菌株的原生質體產量均達到最高，分別為9.12×106 CFU·mL-1和6.48×106 CFU·mL-1，但均與酶解時間5 h無顯著差異；當酶解時間大于5 h時，原生質體產量顯著下降。因此，4～5 h為制備巨大側耳原生質體的適宜酶解時間。

2.3 正交試驗交互作用分析結果

為探究不同因素對原生質體制備的交互影響，采用正交試驗的方法，進一步探究制備巨大側耳原生質體的最適條件。由表3可知，9種正交組合均可用于PG46的原生質體制備和再生。其中，原生質體得率最高的為組合2（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.5%，0.6 mol·L-1的甘露醇，32 ℃酶解4 h），原生質體產量高達11.22×106 CFU·mL-1，顯著高于其他組合。原生質體再生率最高的為組合1（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，30 ℃酶解3 h），再生率達1.20%。可見，PG46原生質體再生與原生質體制備的最適條件存在一定差異。由表3和表4可知，4個主要因素對PG46原生質體制備的影響程度大小依次為菌齡>溶壁酶濃度>酶解溫度>酶解時間，且各因素影響差異極顯著（P<0.001）。

由表5可知，9種正交組合均可用于PG79的原生質體制備，但部分組合不適宜其原生質體再生。其中，PG79原生質體得率最高的為組合3（菌齡5 d，溶壁酶濃度3.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，35 ℃酶解5 h），原生質體產量高達7.28×106 CFU·mL-1，但與組合1和組合2的原生質體得率無顯著差異。原生質體再生率最高的為組合1（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，30 ℃酶解3 h），再生率為0.45%。但是，在原生質體最適制備條件下，原生質體再生率為0。由表5和表6可知，各因素對PG79原生質體制備的影響程度依次為菌齡>酶解時間>酶解溫度>溶壁酶濃度，且各因素影響差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結論

本研究采用單因素實驗和正交試驗的方法，對2株不同溫型的巨大側耳菌株原生質體制備的關鍵因素（菌絲體菌齡、穩滲劑種類、溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時間）進行優化，以期明確巨大側耳原生質體制備的適宜條件。結果表明，組合2是PG46的最適組合，組合1、2、3是PG79的適宜條件組合，而組合3條件下再生率為0，因此PG79的最適條件是組合1和組合2。因此，組合2可同時作為PG46和PG79的適宜條件。同時也說明，各影響因素間存在一定的交互作用，在進行條件優化時不可忽略。F-test分析顯示，菌絲體菌齡對兩株巨大側耳菌株的原生質體產量影響均為極顯著，但溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時間對兩菌株的影響程度存在差異。推測是由于巨大側耳的遺傳多樣性豐富，PG46和PG79菌株間產生了遺傳分化（Dai et al.， 2019）。

菌株的生理狀態和不同的酶解條件，對食用菌原生質體產量和質量均具有不同程度的影響（孫佳星等，2022）。在本研究中，菌絲體的菌齡，是影響巨大側耳原生質體制備的最主要因素。不同時期的菌絲體，細胞壁厚度和生長活力不同，對溶壁酶的敏感性也存在差異（張文學等，2003）。在菌絲生長前期，細胞壁較薄，更易被溶壁酶降解，隨著菌齡的繼續增加，細胞壁逐漸加厚且產生的次生物質增多，酶解效率降低，進而導致原生質體產量下降（Kim et al.， 2000）。本研究前期對巨大側耳菌絲體培養時，發現第5天正是巨大側耳菌絲體生長的指數生長期，此時細胞壁厚度和菌絲體活力均適宜，可作為原生質體制備的理想時期和材料。

由于原生質體失去了細胞壁，對外界環境十分敏感，穩滲劑可保持原生質體內外的壓力平衡，避免其破裂或皺縮（Pasternak et al.， 2002）。同時，穩滲劑在細胞與溶壁酶的反應中起媒介作用，其性質影響溶壁酶的反應活性，因此穩滲劑的選擇非常重要（劉玉霞等，2009）。本研究中，以甘露醇、山梨醇和蔗糖為穩滲劑時原生質體產量均較高，且顯著高于硫酸鎂和氯化鉀。前人研究也發現，有機糖醇穩滲劑和無機鹽穩滲劑在食用菌原生質體制備中影響差異很大（鄒彰毅等，2020；孫佳星等，2022）。產生這一結果可能是因為有機糖醇不僅能維持滲透壓平衡，還能促進酶與底物的結合，進而提高了酶促反應的產量（譚文輝等，2006）。

溶壁酶是裂解細胞壁，獲得原生質體的關鍵，酶的類型和濃度可以影響原生質體的活力和數量（Kanchanapoom & Jantaro， 2001）。

李光環（2018）研究發現，單一的溶壁酶適合多種食用菌的原生質體制備，在保證較高效率的同時成本也較低。但由于不同真菌的細胞壁組成和結構不同，不同濃度的溶壁酶的酶解效果也會有所差異。本研究結果表明，在一定范圍內，溶壁酶濃度越高，原生質體產量越高，但濃度超過2.5%后，原生質體產量開始下降。這可能是因為酶濃度過高會對原生質體的膜造成影響，使得細胞脫壁太徹底，后期也會影響原生質體的再生（孫劍秋和周東波，2002）。

在相同的溶壁酶濃度下，酶解溫度和酶解時間是影響破壁效果的關鍵。根據酶反應的動力學原理，酶解溫度直接影響酶促反應的速度，還會影響細胞壁的生理狀態，適宜的酶解溫度有助于溶壁酶發揮最佳的裂解作用。本研究中，32 ℃為兩菌株的最適酶解溫度，低于該溫度時需適當延長酶解時間來獲得較高的原生質體產量，高于該溫度時原生質體產量下降且再生率也降低。一方面，可能是因為溫度過低時，酶活力不足，且菌絲生理代謝慢，導致酶解反應較慢；溫度過高，會破壞酶的穩定性，降低溶壁酶活性和損傷已游離的原生質體，進一步影響細胞再生率（張麗霞和郭成金，2008；賀婷和郭成金，2012）。另一方面，酶解時間可以影響酶促反應的程度，適當延長酶解時間可獲得較高的原生質體釋放量。本研究中，兩菌株的最適酶解時間均為4 h，超過4 h原生質體產量開始下降。推測是因為失去細胞壁的原生質體穩定性下降，由于酶的作用及滲透作用，酶解時間過長會導致原生質體破裂。并且原生質體再生時需要一定量的細胞壁酶解殘余物，酶解時間過長會導致酶解殘余物過少甚至消失（郭成金和趙潤，2009）。王昱等（2013）研究也發現，酶解時間過長，較早釋放出的原生質體無細胞壁保護而破裂，其活性下降難于再生。因此，適宜的酶解時間尤為重要。

綜上所述，兩株不同溫型巨大側耳菌株的原生質體制備的最適條件相同，但各因素對兩菌株原生質體產量的影響不同。因此，在制備巨大側耳不同菌株的原生質體時，應按照各菌株情況和實驗需求進行適當調整。本研究結果可為后續的巨大側耳雜交育種、遺傳轉化、全基因組測序等工作奠定基礎，有利于推動巨大側耳產業的發展。

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（責任編輯 周翠鳴）