火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性

張麗芳 胡海林 桂騰茸 高秀 徐晴芳 朱鈴 徐啟賀 蔡建

摘 要：? 為了解火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，該研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)火棘內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA V5～V7可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析火棘不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性。結(jié)果表明：（1）從火棘根、莖、葉組織中共獲得內(nèi)生細(xì)菌OTU 1 818個(gè)，其中根部754個(gè)，莖部 308 個(gè)，葉部756個(gè)，三者共有 OTU 152 個(gè)。（2）物種分類(lèi)顯示，不同火棘組織內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的群落多樣性，火棘根部?jī)?nèi)生細(xì)菌種類(lèi)隸屬于23門(mén)53綱137目216科373屬557種，其中異樣根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）和鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度分別為 10.57%和 8.00%；莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌種類(lèi)隸屬于21門(mén)32綱76目126科204屬270種，其中馬賽菌屬（Massilia）和未知分類(lèi)的叢毛單胞菌科屬（unclassified_f_Comamonadaceae）為優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度分別為31.10%和12.82%；葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌種類(lèi)隸屬于21門(mén)52綱130目210科380屬581種，其中土芽孢桿菌屬（Geobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度分別為12.31%和9.84%。（3）PICRUSt功能預(yù)測(cè)表明，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌物種最豐富，參與各種代謝調(diào)控的細(xì)菌豐度最高。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討植物內(nèi)生細(xì)菌功能，挖掘新的有益微生物資源提供了參考。

關(guān)鍵詞： 火棘， 不同組織， 內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性， 高通量測(cè)序技術(shù)， 功能預(yù)測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q939

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）07-1193-08

收稿日期：? 2022-11-10

基金項(xiàng)目：? 云南省教育廳科學(xué)研究基金（2022J0808）。

第一作者： 張麗芳（1987-），博士，講師，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)和植物病理學(xué)，（E-mail）752859175@qq.com。

通信作者：? 蔡建，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称饭こ蹋‥-mail）272101475@qq.com。

Diversity of endophytic bacterial community in

different tissues of Pyracantha fortuneana

ZHANG Lifang1， HU Hailin2， GUI Tengrong3， GAO Xiu1， XU Qingfang1，

ZHU Ling1， XU Qihe1， CAI Jian1*

（ 1. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine， Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China; 2. College of Mathematics

and Statistics， Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China; 3. College of Economics and Management，

Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China ）

Abstract：? In order to understand the diversity of endophytic bacteria community in different tissues of Pyracantha fortuneana， the 16S rRNA V5-V7 variable region of endophytic bacteria in P. fortuneana was sequenced by high-throughput sequencing technology， and the diversity of endophytic bacteria community in different tissue parts of P. fortuneana was analyzed. The results were as follows： （1） A total of 1 818 endophytic bacteria OTU were obtained， in which 754 endophytic bacteria were from root， 308 from stem and 756 from leaf， and with a total of 152 OTU. （2） Species classification showed that endophytic bacteria in different P. fortuneana tissues had abundant community diversities， and the endophytic bacteria in root belonged to 557 species， 373 genera， 216 families， 137 orders， 53 classes， 23 phyla， Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium and Streptomyces were the dominant genera， and their relative abundance was 10.57% and 8.00%， respectively.? The endophytic bacteria in stem belonged to 270 species， 204 genera， 126 families， 76 orders， 32 classes， 21 phyla， Massilia and unclassified_f_Comamonadaceae were the dominant genera， and their relative abundance was 31.10% and 12.82%， respectively. The endophytic bacteria in leaf belonged to 581 species， 380 genera， 210 families， 130 orders， 52 classes， 21 phyla， Geobacillus and Pseudomonas were the dominant genera， and their relative abundance was 12.31% and 9.84%， respectively. （3） PICRUSt function prediction analysis showed that the species richness of root endophytic bacteria involved in te regulation of various metabolic pathways was the highest. These results provide a reference for endophytic bacteria functions and exploiting new beneficial microbial resources.

Key words： Pyracantha fortuneana， different tissues， diversity of endophytic bacterial community， high-throughput sequencing technology， function prediction

火棘（Pyracantha fortuneana）為薔薇科（Rosaeeae）常綠灌木野生果樹(shù)植物，在云南地區(qū)分布廣泛，具有適應(yīng)性廣、防風(fēng)固沙能力強(qiáng)等生態(tài)價(jià)值，還是一種天然藥食同源的水果資源（俞德浚和江萬(wàn)福，1974；李加興等，2012；張俊輝，2014）。研究表明，在不同或相同植物的不同根、莖、葉、花、種子和根瘤等不同組織中均有內(nèi)生細(xì)菌的存在，內(nèi)生細(xì)菌與寄主植物之間在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中建立一種和諧共處的平衡關(guān)系，不會(huì)導(dǎo)致植物侵染性病害發(fā)生，在植物體內(nèi)形成微生態(tài)群落，對(duì)植物本身具有促生、抗病、抗蟲(chóng)、抗逆、內(nèi)生固氮以及促進(jìn)生防種質(zhì)資源的研制與利用等多種生物學(xué)作用（樊劍波等，2008； Ownley et al.， 2010; 李亮亮等，2017； Pham et al.， 2017; Defez et al.， 2017; Xu et al.， 2017； 楊鑫等，2018），由此推測(cè)，內(nèi)生菌常與火棘重要價(jià)值有關(guān)（Beckers et al.， 2017; Suryanarayanan et al.， 2017; 張愛(ài)梅等， 2019）。目前，關(guān)于火棘內(nèi)生菌的研究主要為火棘內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性測(cè)定，在火棘不同組織中共分離出15株（陳志敏等，2010），而關(guān)于火棘內(nèi)生細(xì)菌研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，Illumina高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究迅速崛起，該技術(shù)可直接從基因組DNA層面快速分析植物內(nèi)生菌群落組成及多樣性（Livak ＆ Schmittgen， 2001）。本研究以火棘根、莖和葉不同組織為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)探討以下問(wèn)題：（1）火棘內(nèi)生細(xì)菌結(jié)構(gòu)及多樣性分析；（2）火棘內(nèi)生細(xì)菌群落組成及差異分析；（3）火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌功能預(yù)測(cè)。旨在為獲得有益生防細(xì)菌信息資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采集地概況

火棘樣品于2021年10月采自云南省曲靖市曲靖師范學(xué)院火棘試驗(yàn)田，地理位置坐標(biāo)為103°72′ E、25°72′ N，海拔約為1 876 m。該地區(qū)位于云南省滇東北地區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，氣溫為12～22 ℃，年均降水量在1 000 mm以上，其高海拔和低緯度是火棘生長(zhǎng)得天獨(dú)厚的自然生態(tài)條件。

1.2 樣品采集

在采集地選擇不同分布多位點(diǎn)的5株生長(zhǎng)良好的火棘植株，將整棵植株小心挖出后抖落土壤，不傷害根系，并將植株立即放入無(wú)菌樣品袋中，火棘根、莖、葉不同組織樣品各3個(gè)重復(fù)，分別命名為HJG、HJJ、HJY，置于4 ℃環(huán)境下保存，并在48 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理。

1.3 樣品處理

稱(chēng)取相同重量火棘根、莖、葉不同組織樣品，用自來(lái)水沖洗10 min，無(wú)菌紙吸干水分，75% 乙醇處理4 min，經(jīng)無(wú)菌水洗滌后，用3% NaClO浸泡3 min，再用無(wú)菌水沖洗3～4次，最后一遍無(wú)菌水洗滌液經(jīng)涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基檢測(cè)，確認(rèn)無(wú)菌后，對(duì)樣品內(nèi)生菌基因組DNA進(jìn)行提取（李亮亮，2021）。

1.4 基因組 DNA 的提取及擴(kuò)增測(cè)序

采用FastDNASpinkit（MPBiomedicals）試劑盒對(duì)火棘不同組織樣本進(jìn)行總DNA的提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的純度和濃度后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和高通量測(cè)序。本研究選用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）/1392R（5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′）和799F（5′-AACMGGAT

TAGATACCCKG-3′）/1193R（5′-ACGTCATCCCCAC

CTTCC-3′），該引物可在一定程度上避免寄主植物葉綠體和線(xiàn)粒體的污染（Bulgarelli et al.， 2012; Lundberg et al.， 2012; Bulgarelli et al.， 2015）。通過(guò)PCR對(duì)火棘內(nèi)生菌16S rRNA V5～V7可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系為4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），0.8 μL 5 μmol·L-1上下游引物，0.4 μL FastPu Polymerase， 1 μL 10 ng·μL-1 DNA模板，0.2 μL BSA，用dd H2O補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用高通量技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序完成后，使用Flash軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接并篩選有效序列，然后使用Uparse軟件進(jìn)行OTU聚類(lèi)。通過(guò)Mothur和PICRUSt等軟件對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行Alpha多樣性分析，代謝功能預(yù)測(cè)分析，從而獲得火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌功能相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 火棘不同組織樣品稀釋曲線(xiàn)分析

圖1和圖2反映了樣品測(cè)序深度，檢驗(yàn)本次測(cè)序結(jié)果是否真實(shí)準(zhǔn)確地覆蓋整個(gè)類(lèi)群，圖中橫坐標(biāo)表示樣品reads數(shù)量，縱坐標(biāo)表示OTU水平多樣性指數(shù)。由圖1可知，隨著測(cè)序reads數(shù)量增加，火棘根莖葉內(nèi)生菌Sobs指數(shù)有微上升趨勢(shì)，表明火棘葉中仍有部分內(nèi)生群落的種群尚未被檢測(cè)，若增加測(cè)序量，會(huì)增加樣本的OTU數(shù)量。但圖2中Shannon稀釋曲線(xiàn)顯示，隨著測(cè)序reads數(shù)量增加，火棘根莖葉內(nèi)生菌Shannon指數(shù)已趨于平緩，說(shuō)明增加測(cè)序量并不會(huì)增加樣本的OTU數(shù)量。因此，基于現(xiàn)有測(cè)序數(shù)據(jù)得到的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌OTU聚類(lèi)及其多樣性分析

由圖3可知，通過(guò)對(duì)火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析后共得到OTU數(shù)1 818個(gè)，其中，根的OTU數(shù)為754個(gè)，莖為308個(gè)，葉為756個(gè)，火棘的根、莖、葉共有的OTU數(shù)為152個(gè)，其中，莖、葉共有54個(gè)，根、葉共有256個(gè)，根、莖共有23個(gè)。

通過(guò)對(duì)火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序后，由表1可知，不同組織內(nèi)生菌有效序列條數(shù)不同，分別為根41 948條、莖37 180條、葉40 996條，基于OTU水平對(duì)不同組織內(nèi)生菌進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示群落多樣性，Shannon指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越低表明內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性越高，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)表示群落豐富度，指數(shù)值越高，說(shuō)明群落豐富度越大。由表1可知，火棘不同組織內(nèi)生菌群落多樣性和豐富度存在差異，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富度最高，莖部和葉部次之。

2.3 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌種群歸類(lèi)分析

對(duì)火棘根、莖、葉不同組織內(nèi)生細(xì)菌物種分類(lèi)階層統(tǒng)計(jì)分析，火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌一共可歸類(lèi)為29個(gè)門(mén)、71個(gè)綱、175個(gè)目、289個(gè)科和533個(gè)屬和852個(gè)種。火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌的分類(lèi)階層存在較大差別。由表2可知，其根部和葉部的內(nèi)生細(xì)菌多樣性最為豐富，莖部次之。

2.4 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落組成及差異分析

2.4.1 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌門(mén)水平群落組成分析 由圖4可知，所測(cè)3組不同組織樣品中豐度較高的群落為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria），不同組織中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)豐度差異很大，其中根中為59.12%變形菌門(mén)、5.25%厚壁菌門(mén)和30.35%放線(xiàn)菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)；莖中為68.15%變形菌門(mén)、19.74%厚壁菌門(mén)和9.32%放線(xiàn)菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)；葉中為48.14% 變形菌門(mén)、31.56%厚壁菌門(mén)和14.26%放線(xiàn)菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。

2.4.2 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌科水平群落組成分析

由圖5可知，不同組織中優(yōu)勢(shì)菌科存在很大差別，在火棘根中優(yōu)勢(shì)菌科為15.30%根瘤菌科（Rhizobiaceae）、9.75%黃色桿菌科（Xanthobacte-raceae）、8.00%鏈霉菌科（Streptomycetaceae）和6.84%分支桿菌科（Mycobacteriaceae）和5.29%類(lèi)諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）；火棘莖中優(yōu)勢(shì)菌科為31.18%草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、14.88%叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、7.18%假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和6.17%葡萄球菌科（Staphylococcaceae）；火棘葉中優(yōu)勢(shì)菌科為13.07%芽孢桿菌科（Bacillaceae）、9.84%假單胞菌科、8.31%草酸桿菌科、7.33%黃色桿菌科、5.34%叢毛單胞菌科和5.22%乳桿菌科（Lactobacillaceae）。

2.4.3 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌屬水平群落組成分析 由圖6可知，不同組織中優(yōu)勢(shì)菌屬存在很大差別，在火棘根中優(yōu)勢(shì)菌屬為10.57%異樣根瘤菌屬、8%鏈霉菌屬、6.84%分支桿菌屬（Mycobacterium）、4.56%類(lèi)諾卡氏菌屬（Nocardioides）、5.28%慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）；火棘莖中優(yōu)勢(shì)菌屬為31.1%馬賽菌屬、12.82%未知分類(lèi)的叢毛單胞菌科屬、7.18%假單胞菌屬（Pseudomonas）、6.17%葡萄球菌屬（Staphylococcus）；火棘葉中優(yōu)勢(shì)菌屬為8.03%馬賽菌屬、12.31%土芽孢桿菌屬（Geobacillus）、9.84%假單胞菌屬、4.71%乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.5 火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌KEGG代謝通路分析

將所測(cè)的基因數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，從而獲得火棘不同組織內(nèi)生細(xì)菌的代謝通路相關(guān)信息（表3）。由表3可知，火棘內(nèi)生細(xì)菌所有菌群參與的生物代謝通路有7類(lèi)，包括新陳代謝細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類(lèi)疾病、新陳代謝、生物體系統(tǒng)和未知分類(lèi)，其中根部參與各種功能活動(dòng)的內(nèi)生細(xì)菌物種豐度相對(duì)較高，而莖部和葉部參與調(diào)控各種代謝的內(nèi)生細(xì)菌豐度相對(duì)較低。

3 討論與結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)火棘根、莖、葉不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究。本研究結(jié)果表明，火棘不同組織內(nèi)存在豐富的內(nèi)生細(xì)菌，不同組織內(nèi)生細(xì)菌在不同分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)菌群、細(xì)菌多樣性及豐度信息存在較大差異。植物內(nèi)生菌具有自身獨(dú)特的組織專(zhuān)一性，并且植物不同組織間內(nèi)生菌多樣性結(jié)構(gòu)隨植物的不同具有一定的差異（許國(guó)琪等，2020；顧美英等，2021），這種差異性可能與其自身所處生境的特殊性及其在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中形成了自身獨(dú)特的細(xì)菌群落特征。本研究中火棘不同組織內(nèi)生菌共隸屬于29個(gè)門(mén)71個(gè)綱175個(gè)目289個(gè)科533個(gè)屬852個(gè)種，表現(xiàn)出豐富的生物多樣性。在門(mén)分類(lèi)水平上，變形菌門(mén)是火棘不同組織內(nèi)的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，在根部、莖部和葉部的豐度分別為59.12%、 68.15%和48.14%。在植物體內(nèi)，變形菌門(mén)的物種和遺傳多樣性極其豐富，分布最為廣泛，常被應(yīng)用于植物病害防治和生物固氮（殷冬梅等，2013；李穎波等，2016；劉豪等，2019；李亮亮，2021）。同時(shí)，該菌門(mén)在火棘根、莖和葉中也占有較高的比例，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生種類(lèi)較多的抗生素（Kazuhide et al.， 2014；李亮亮，2021），是一類(lèi)非常重要的生防微生物。另外，根中分離到的鏈霉菌屬具有抑制作用；異樣根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬具有固氮作用，這與張愛(ài)梅等（2021）的研究結(jié)果相同。火棘莖葉中含量最多的馬賽菌屬具有溶磷作用（Zhao et al.， 2017 ），假單胞菌屬和土芽孢菌屬具有生防作用。

對(duì)火棘不同組織內(nèi)有效測(cè)序數(shù)和OTU數(shù)的研究表明，火棘根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的有效測(cè)序數(shù)和OTU數(shù)目最多，多樣性最為豐富，莖部和葉部次之，這與一些研究者研究結(jié)果相似，如對(duì)花生、水稻和小麥等研究中，根部的內(nèi)生細(xì)菌多樣性均高于其他組織（林標(biāo)聲等，2018；沙月霞，2018; Kiani et al.， 2019；李亮亮等，2021），這可能與根部部分內(nèi)生菌來(lái)源于土壤，土壤中的部分微生物可以進(jìn)入火棘根系有關(guān)，但隨著火棘植株的生長(zhǎng)發(fā)育，土壤中的一些微生物進(jìn)入火棘根系后沒(méi)有繼續(xù)沿維管束系統(tǒng)擴(kuò)展，從而成為根部的獨(dú)有物種。

PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)分析表明，火棘不同組織中參與新陳代謝相關(guān)內(nèi)生細(xì)菌的功能基因相對(duì)豐度最高，這可能與火棘含有豐富的氨基酸、維生素、果膠和可溶性糖等活性成分有關(guān)。另外，火棘內(nèi)生細(xì)菌基因中也包含有維生素、氨基酸類(lèi)、萜類(lèi)、多糖和酮類(lèi)及其他次生代謝產(chǎn)物等與植物成分生物合成有關(guān)的通路。這與趙柏霞和閆建芳（2023）研究結(jié)果相似。因此，通過(guò)獲得火棘不同組織中內(nèi)生細(xì)菌與有效化學(xué)成分合成的相關(guān)基因信息，協(xié)調(diào)火棘中有效成分生物合成和運(yùn)輸分解，為挖掘內(nèi)生細(xì)菌資源提供一定的參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）