基于數據挖掘的糖尿病前期動物模型應用特點分析?

肖穎馥,盛 文,張錦明,朱從旭,李波男,何清湖,3△

(1.湖南中醫藥大學,長沙 410208;2.廣東省中醫院,廣州 511400;3.湖南醫藥學院,湖南懷化 418000)

糖尿病前期,通常定義為血糖水平高于正常但低于糖尿病閾值的階段,是糖尿病的高風險狀態,年轉化率為5%～10%[1]。在全球范圍內,糖尿病前期的患病率正在上升,預計到2030年,將有4.7億人處于糖尿病前期[2]。研究顯示,糖尿病前期與早期腎病、慢性腎病、小纖維神經病變、糖尿病視網膜病變和大血管疾病風險增加有關。對糖尿病前期的有效干預可以延緩甚至逆轉糖尿病進程,是預防糖尿病及其并發癥發生發展的重要機會窗口[3],具有巨大的社會、醫療和經濟影響。

動物模型是實驗研究的重要載體,通過穩定的模型對疾病的病理生理學、潛在的干預措施和候選藥物進行研究和測試,顯著地提高了研究人員對疾病發展、演變的理解[4]。雖然糖尿病前期是糖尿病的前驅階段,但某些干預因素用糖尿病模型進行評估可能顯示無效,而用糖尿病前期模型評估則可能有效。此外,糖尿病前期模型可以用來更準確地評估糖尿病前期的惡化因素和防治措施,如果應用糖尿病模型可能會造成結果偏倚[5]。目前已有研究人員進行了糖尿病前期的動物實驗研究,創造了多種可行的造模方式,但目前尚無一種公認的理想模型,也暫無綜述對糖尿病前期的造模方法進行梳理闡述。因此本研究從實驗動物種類、造模方法、造模周期、模型特點、成模標準、高頻檢測指標、干預方式等方面對國內外糖尿病前期動物實驗模型進行歸納,總結不同模型的造模方法、模型原理和模型特點,以幫助研究人員更快速的選擇合適的動物模型。

1 資料與方法

1.1 文獻來源與檢索方法

在中國知網、維普、萬方數據庫以“糖尿病前期”并且“動物模型”或“鼠”或“兔”或“犬”或“豬”為主題詞進行檢索,在 PubMed 數據庫以“prediabetes” AND “animal model”OR“mouse”OR“rabbit”OR“dog”OR“pig”為主題檢索,鎖定檢索年限限定為 1992 年 11 月至 2022 年 11 月。

1.2 納入標準

“糖尿病前期”相關的動物模型實驗研究文獻;造模方法完整;實驗過程清晰;文獻為原始一次動物實驗研究類文獻。

1.3 排除標準

會議、報紙、綜述等文獻;糖尿病前期相關體外實驗文獻;重復發表文獻。

1.4 文獻篩選及數據處理

如圖1所示,共檢索到相關文獻305篇,剔除重復文獻,根據納入排除標準,最終納入文獻128篇,其中中文文獻31篇,英文文獻97篇。實驗動物名稱、種類等均參照《實驗動物和動物實驗技術》[6]進行規范總結。將篩選出的文獻中實驗動物種類、性別、造模方法、造模周期、陽性藥、檢測指標等數據錄入Excel表,建立糖尿病前期動物模型數據庫,進行頻次和頻率的統計。使用Prism軟件進行繪圖。

圖1 文獻篩選流程圖

2 結果

2.1 糖尿病前期造模動物種類

對 128 篇文獻中使用的動物種類進行統計,使用頻數>20 的動物共有 3 種,最常用的為 Wistar大鼠(35次,29.4%),其次為SD大鼠(27 次,22.7%)、C57BL/6J小鼠(25 次,21%)。動物年齡多為(4～6)周齡、(6～8)周齡。動物種類分布情況見圖2。

2.2 糖尿病前期動物模型動物性別分布

對128 篇文獻進行動物性別分布分析,有 26 篇文獻未注明動物性別,故不計入統計。結果發現雄性動物應用最多,頻數為81次,占比79.4%;雌性動物應用頻數為15次,占比14.7%;雌雄各半應用頻數為6次,占比5.9%(圖3)。相較于雌性大鼠,雄性大鼠可以避免受孕等因素的干擾,且成模率更高,這可能是更多研究人員選擇雄性的原因[7]。

圖3 糖尿病前期動物模型性別分布

2.3 糖尿病前期動物模型造模方法

對 128 篇文獻中的造模方法進行統計分類,可分為飲食誘導、化學誘導、復合造模、基因工程、自發造模5大類。占比最高的造模方式為飲食誘導(85次,66.5%),自發模型為僅次于飲食誘導的造模方式(16次,12.5%),其次為復合造模(13次,102.%)、化學誘導(8次,6.3%)和基因工程(6次,4.7%)。飲食誘導類型可以分為高脂肪飼料誘導、高蔗糖飼料誘導、高脂肪+果糖飼料誘導以及高脂肪+蔗糖飼料誘導,其中高脂飲食誘導為主要造模方式(61次,47.7%)。自發模型中以由JCL-ICR品系小鼠衍生的白內障易感亞型 (CTS) 糖尿病小鼠近親雜交而來的非肥胖糖尿病(no obesity diabetes,NOD)小鼠為多[8]。復合造模多為高脂肪飲食聯合鏈脲佐菌素(streptozotocin injection,STZ)誘導的造模方式,通常為高脂飼料喂養4～8周后予STZ單次腹腔注射,STZ的劑量多為15～20 mg/kg,也有高糖高脂飼料喂養聯合STZ少量多次腹腔注射(每次10 mg/kg,累計劑量30 mg/kg)誘導的糖尿病前期模型。化學誘導中以單次腹腔注射STZ(40 mg/kg)居多。不同的造模方法其模型特點有所不同,具體見表1。

表1 不同類型糖尿病前期動物模型的造模方法及特點

2.4 飲食誘導的飼料類型、配比

128篇文獻中有85篇文獻采用飲食誘導方法進行造模,因此本文對飲食誘導造模所選用的不同飼料類型進行統計,依據飼料成分配比分為高脂肪飼料、高蔗糖飼料、高脂肪飲食+果糖飼料、高脂肪飲食+蔗糖飼料。高蔗糖飼料為飲用水中加入蔗糖配制成蔗糖溶液,蔗糖占比主要為30%～35%。果糖飼料以15%的果糖水為主要配比。高脂肪飼料中,碳水化合物供能比主要為20%～40%;蛋白質供能比主要為20%～40%;脂肪供能占比主要為50%～60%(25次,48.1%),其次為40%～50%(16次,30.8%),具體分布詳見表2。

表2 高脂肪飼料中脂肪供能比

2.5 糖尿病前期大小鼠造模周期

128篇文獻中,大小鼠均為主要的糖尿病前期造模動物,故對大小鼠的造模周期進行統計。以“t”代表造模周期,統計結果發現,在大鼠實驗中以16周≤t≤20周的造模周期最多;在小鼠實驗中以11周≤t≤15周的造模周期最多,具體見表3。

表3 糖尿病前期動物模型造模周期表(頻數/次)

2.6 糖尿病前期動物模型成功制備標準

動物模型的成功復制是動物實驗中至關重要的環節,模型成功建立的評價標準尤為重要。在檢索到的動物實驗中有17篇文獻沒有提及模型成功制備標準,共有111篇文獻表述模型成功制備的評定要素。其中,空腹/餐后血糖、血清胰島素水平、葡萄糖耐量是評估模型成功的重要指標。大部分文獻以空腹血糖或糖負荷2小時血糖升高(5.6 mmol/L<空腹血糖<7.0 mmol/L,7.8 mmol/L<糖負荷后2 h血糖<11.1 mmol/L)、胰島素抵抗作為成模判定標準。此外,也有不少文獻以美國ADA糖尿病前期診斷標準作為造模成功判定標準,具體見表4。

表4 糖尿病前期動物模型成功制備標準

2.7 糖尿病前期動物模型高頻檢測指標

將涉及體內動物模型的128篇文獻中的實驗檢測指標進行分類,若同一組織檢測指標手段、項目類型相同,如用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)同時檢測血清中的丙二醇(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量,則將其歸為一類[36];若同一組織檢測手段為不同類型,如血清檢測血清胰島素(INS)和糖化血紅蛋白(HbA1c)等指標,則分開計算。通過對檢測指標的梳理,選取頻數≥5 次的指標。其中,空腹血糖檢測頻數最高,為 52 次,占比17.4%;其次為糖耐量實驗、ELISA法檢測血清胰島素及體質量,頻數分別為46、38和37次,分別占比15.4%、12.8%和12.4%,見表5。

表5 糖尿病前期動物模型高頻檢測指標表(頻數≥5)

2.8 糖尿病前期動物模型干預方式

在糖尿病前期的體內動物實驗中,涉及干預方式的文獻共有 52 篇,根據干預方式的不同可以分為5大類,分別是西藥、中藥和中藥提取物、植物和植物提取物、運動以及飲食干預。西藥為占比最高的干預方式(15次,28.8%),以二甲雙胍為主要代表藥物,其次為中藥及中藥提取物(14次,26.9%)、植物及植物提取物(12次,23.1%)。運動也是干預糖尿病前期的重要方式(6,11.5%),詳見表6。

表6 糖尿病前期動物模型干預方式

3 討論

3.1 常用實驗動物分析

目前用于制備糖尿病前期的動物種屬有大鼠、小鼠、豬以及狗,大鼠中 Wistar大鼠、SD大鼠、ZDF大鼠、OLETF大鼠為常用動物,Wistar大鼠在飲食(高脂飲食、高蔗糖飲食、高脂肪+蔗糖)、高脂飲食+STZ、STZ相關的5種造模方法中均有應用。SD大鼠主要在高脂肪飲食、高脂肪飲食+果糖、高脂肪+蔗糖、高脂飲食+STZ、3脫氧葡萄糖醛酮相關的造模方法中使用。ZDF大鼠、OLETF大鼠為自發性造模大鼠,二者的主要表型有肥胖、胰島素抵抗及高血糖。小鼠中C57BL/6J小鼠、NOD小鼠、BALB/c小鼠為常用小鼠。C57BL6/J小鼠主要應用在高脂肪飲食、高脂飲食+STZ的造模方法中,BALB/c小鼠主要應用于化學誘導造模中。NOD小鼠是一種自發性非肥胖糖尿病小鼠,是典型的1型糖尿病模型,在未發展為1型糖尿病前可作為1型糖尿病前期的研究模型。狗及豬的動物飼養成本均較高、實驗操作難度偏大,且繁殖周期長,所以糖尿病前期動物模型中該動物種屬選擇偏少。

3.2 常用造模方法分析

飲食誘導法是利用高糖高脂的飲食連續飼喂實驗動物,因為高脂肪飲食會導致體重增加,隨著時間的推移,會出現持續高血糖,血清胰島素水平會逐漸增加,進而出現胰島素抵抗[37]。飲食誘導的糖尿病前期模型多表現肥胖、血糖升高、糖耐量受損、血清胰島素水平升高等特征,能很好地模擬人類糖尿病前期的發病和進展,被人們所青睞。但該方法造模時間較長,多數大鼠的造模周期為16～20周,小鼠造模周期為12～16周。同時,飲食誘導的糖尿病前期大鼠需維持高脂飼料喂養。研究顯示將糖尿病前期小鼠的高脂飼料切換到標準飼料喂養,可減輕糖尿病前期小鼠的體重,降低血脂水平及改善胰島素敏感性[38]。

化學誘導法是指通過化學致病因素損傷動物胰島、破壞胰島細胞,引起胰島素合成減少或拮抗胰島素作用引起胰島β細胞功能紊亂,進而導致糖代謝異常。主要的化學致病因素有STZ、四氧嘧啶及3-脫氧葡萄糖醛酮。STZ和四氧嘧啶的機理相似,主要模擬1型糖尿病前期病理表現[19,39];3-脫氧葡萄糖醛酮誘導法是通過灌服3-脫氧葡萄糖醛酮,使其沉積于動物腸組織,引起羰基壓力和氧化壓力增加,進而增加結腸黏膜通透性,損傷腸組織L細胞,使循環活性氧、炎癥因子水平升高、GLP-1介導的腸促胰島素效應減弱,引起胰島β功能紊亂。主要表現有葡萄糖調節受損,并伴有明顯的胰島細胞功能障礙[40]。

自發性糖尿病前期動物模型是指在自然條件下,未經過人工處理而發病的實驗動物,主要動物品系有GK、ZDF、BB、OLETF大鼠和db/db、NOD小鼠。這些動物在自然條件下可自發發展為糖尿病模型,在血糖正常至發展為糖尿病的中間過渡階段屬于糖尿病前期,不同的自發性糖尿病模型有不同的發病機制,BB大鼠、NOD小鼠模擬1型糖尿病前期模型,GK、ZDF、OLETF大鼠和db/db小鼠模擬2型糖尿病前期模型[41-42]。根據不同機制和病理表現,可用于不同類型的抗糖尿病前期藥物的評價。

基因工程動物模型是利用基因修飾技術對特定DNA片段進行定點替換、敲除或敲入來實現基因表達的上調或下調,從而構建基因相關的動物模型。目前糖尿病前期的基因工程動物模型有B細胞克隆、Tspo基因敲除及葡萄糖激酶基因敲除。葡萄糖激酶是葡萄糖代謝途徑中的一種限速酶,敲除葡萄糖激酶會導致葡萄糖刺激胰島素分泌受損和高血糖,但不會導致糖尿病。Tspo基因敲除的小鼠,血糖水平符合糖尿病前期診斷標準,但對促腎上腺皮質激素沒有反應,適合于血糖及應激關系的研究。

3.3 造模周期分析

不同造模方法的造模周期各不相同,飲食造模主要為通過高脂飼料的長時間喂養,導致胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂,造模周期偏長,需要12～16周[43]。化學造模、基因工程造模及復合造模的造模周期相對要短一些。自發性造模周期則與大小鼠的品種相關,如db/db 小鼠在1個月時開始貪食及發胖, 繼而產生高血糖、高血胰島素等糖尿病前期的表現;ZDF 大鼠在4周齡時出現胰島素抵抗和高血糖;GK大鼠以2～3周齡為多[44]。

3.4 高頻檢測指標分析

空腹血糖、糖耐量試驗及血清胰島素檢測是高頻檢測指標。空腹血糖為隔夜空腹(至少8～10 h)后采集血液檢測出的血糖值,反映動物模型的基礎血糖,一般空腹血糖升高代表存在血糖調節不良[45]。糖耐量試驗是通過給予糖負荷后測定多個時間點的血糖,綜合評估血糖水平的變化趨勢和時間累積效應,用以了解胰島β細胞功能和機體對血糖的調節能力[46]。通常口服或者腹腔給予葡萄糖后血糖水平會迅速升高,進而刺激機體分泌胰島素以降低血糖水平[47]。如果測試后血糖不能在短時間恢復到正常水平,則認為該動物存在糖耐量異常,可結合血清胰島素水平進一步判斷動物胰島素抵抗和胰島分泌功能。在生化指標中,血脂、炎癥細胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)也是高頻檢測指標,反映脂代謝紊亂和炎癥因子是糖尿病前期研究的熱門內容,對今后病理、藥理機制研究具有一定的指導意義。

3.5 陽性藥物種類分析

在西藥干預中,西藥以雙胍類和GLP-1為主,干預中藥主要包括復方中藥和單味中藥提取物,中藥復方主要包括芪山顆粒、脾癉寧、葛根芩連湯、四君子顆粒等,復方多有健脾功效。中藥提取物主要包括地黃提取物、金銀花提取物、黃連提取物、蕎麥提取物、木蝴蝶提取物,多具有清熱的功效。中藥改善糖尿病前期的主要機理有抑制α-葡萄糖苷酶、增加腸道GLP-1的分泌、改善腸道微生物群和抗氧化損傷[48-49]等。

4 討論

通過對4種數據庫糖尿病前期動物模型文獻的統計分析發現,糖尿病前期動物模型主要以鼠類為主要來源,大鼠以Wistar和Sprague Dawley為主,小鼠以C57BL/6J為主;造模方法以飲食誘導大(小)鼠糖尿病前期模型為主,在高脂飼料飲食配比上,脂肪供能占比主要為50%～60%,碳水化合物供能比主要為20%～40%,蛋白質供能比主要為20%～40%,造模周期相對偏長,大部分在16～20周左右。其次,自發造模的糖尿病前期模型也比較常用,不同的自發模型大鼠各有其模型特點和適用性,可根據不同的研究需求適當選擇。在高頻檢測指標中,以空腹血糖、糖耐量試驗(OGTT、IPGTT)、血清胰島素檢測為主,以判定模型的胰島素抵抗和糖代謝情況;在干預方式中,西藥以二甲雙胍為主,中藥有芪山顆粒、脾癉寧等復方,也有地黃、金銀花及黃連等提取物。

目前圍繞糖尿病前期發病機制及病因而研發的動物模型不斷增多,但仍有一定的局限性:①目前最常用的高脂飼料誘導模型,能夠較好模擬糖尿病前期典型特征,但該模型建模周期長,成本高,血糖升高存在個體差異。基因工程模型現仍處于摸索階段,技術難度大,難以大規模應用[50];自發模型進展為糖尿病的時間各不相同,品系較為繁雜,模型動物的病變發展特性與人類有所差異,且成本高,模型較難控制[51]。復合造模的方法雖造模時間短,但化學誘導劑的用量和注射方式尚未統一,需要進一步的實驗研究和論證。因此,目前糖尿病前期動物模型雖有多種造模方式,但仍存在進一步發展和改良的空間。②雖然目前的糖尿病前期動物模型可以較好地模擬高血糖、胰島素抵抗、胰島素功能障礙的典型特征,但對糖尿病前期模型在腎臟、心臟、血管等方面的評估尚缺少有力的證據,且不同糖尿病前期模型在胰腺、肝臟等病理學改變也缺乏比較研究。③中醫藥是糖尿病前期重要的干預方式,糖尿病前期在中醫中歸屬“脾癉”范疇,辨證可分為濕熱蘊脾、氣陰兩虛、脾虛濕盛等證型[52],但在四個數據庫檢索到的造模方法中暫無病與證結合的模型,僅以西醫成模標準來說明模型成立,即給予中醫藥干預治療,這些實驗方法雖可行但缺乏一定的科學性。

動物模型是臨床研究和實驗研究的橋梁,制備理想的動物模型是開展實驗研究的前提。本文通過文獻梳理及數據分析,對近30年糖尿病前期動物模型的造模方法、模型特點、優缺點及判定標準進行整理比較,并針對其個別不足之處進行探討,希望本文可以為今后廣大研究者建立更加簡便可行、穩定且更符合發病機理的動物模型提供參考。