蛭龍活血通瘀膠囊與氯吡格雷聯用對阿司匹林抵抗大鼠的療效及機制研究?

鄧谷霖,黃新武,許 紅,李秋月,李國春,3△

(1.西南醫科大學附屬中醫醫院,四川瀘州 646000;2.西南醫科大學藥學院,四川瀘州 646003;3.國家中醫臨床研究基地建設單位,四川瀘州 646000)

阿司匹林是一種非甾體抗炎藥,臨床也可用于抑制血小板黏附和聚集,降低患者的心肌梗死和中風發生率。但由于其抗血小板聚集療效因人而異,導致部分患者對其反應不佳,這種情況被稱為阿司匹林抵抗(aspirin resistance,AR)。有文獻表明,AR的發生率為0.4%～83%,個體化差異較大[1]。目前,西藥治療AR的效果并不理想,而中藥復方制劑具有多靶點、多信號通路的特點,對心腦血管系統栓塞性疾病的預防具有獨特優勢。基于此,本研究將蛭龍活血通瘀膠囊和氯吡格雷聯合使用,通過血栓彈力圖(thromboela-stogram,TEG)法和ELISA法觀察其對AR大鼠血小板聚集功能、血栓素(thromboxane,TX)B2和6-酮-前列腺素(6-keto-prostaglandin,6-keto-PG)F1α的影響,并通過熒光定量PCR法檢測大鼠miRNA-126-3p水平,以探索其可能的作用機制。本研究已通過西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準,編號:2021-0301。

1 材料

1.1 動物

6周齡健康雄性SD大鼠70只,體質量160～200 g,由成都生物制品有限責任公司提供,許可證號:SCXK(川)2013-0028。動物飼養于西南醫科大學動物實驗中心,采用全新風過濾系統,控制溫度20～25 ℃,濕度50%～65%。飼養環境安靜無噪聲,并采用光照定時裝置保持晝夜光變化周期,每周更換2～3次墊料。

1.2 藥物

乙酰水楊酸原料藥(批號:20200109)與布洛芬原料藥(批號:20190505),由武漢貝爾卡藥業有限公司提供;硫酸氫氯吡格雷片(批號:Q04201136),規格:75 mg×14片,由石藥集團歐意藥業公司提供;蛭龍活血通瘀膠囊(批號:20210216),規格:0.4 g×48粒,由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室提供。

1.3 主要試劑與儀器

逆轉錄試劑盒(貨號:FSQ-101)、RNA擴增試劑盒(貨號:QPK-201),日本TOYOBO公司;大鼠TXB2 ELISA試劑盒(貨號:CK302174R)、6-keto-PGF1αELISA試劑盒(貨號:CK303044R),泉州睿信公司。

RP 5301型熒光定量PCR儀,北京百泰克公司;TEG 5000型血栓彈力圖儀,美國Haemonetics公司;SpectraMax M3型多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司。

2 方法

2.1 分組與造模

70只雄性SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為正常組和造模組,正常組20只,造模組50只。正常組大鼠采用普通飼料喂養12周,造模組大鼠采用高脂高糖高鹽飼料(普通飼料70.8%,食用豬油15%,蔗糖10%,食鹽4%,膽固醇0.2%)喂養12周[2],并在9～12周時給予原料藥乙酰水楊酸(2.7 mg/100 g/d)和布洛芬(3.6 mg/100 g/d)灌胃造模。造模結束后,正常組和造模組各隨機挑選10只大鼠,麻醉后取血,經TEG檢測顯示造模組花生四烯酸誘導的血小板聚集抑制率<50%,表明阿司匹林抵抗大鼠模型造模成功[3]。將造模組剩余的40只大鼠隨機分為模型組、蛭龍膠囊組、氯吡格雷組與聯合用藥組,每組各有10只大鼠。

2.2 給藥方法

造模成功后開始給藥,蛭龍膠囊組大鼠給予蛭龍活血通瘀膠囊50 mg/100 g/d,氯吡格雷組大鼠給予硫酸氫氯吡格雷片0.7 mg/100 g/d,聯合用藥組大鼠給予蛭龍活血通瘀膠囊50 mg/100 g/d加硫酸氫氯吡格雷片0.7 mg/100 g/d,正常組和模型組大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,均持續4周。

2.3 取材

第16周給藥結束后,所有大鼠以0.2 mL/100 g劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉,麻醉后腹主動脈采血送檢。另取部分血液轉入凍存管中,立即投入液氮速冷,-80 ℃保存備用。采血后將大鼠脊椎脫臼進行處死。

2.4 TEG檢測

每只大鼠取血2 mL于抗凝采血管中立刻送檢TEG,采用TEG分析儀及配套試劑檢測血小板聚集抑制率[4]。

2.5 ELISA檢測

每只大鼠取血1 mL至抗凝采血管,離心后取上層血清,按照ELISA試劑盒說明書檢測TXB2和6-keto-PGF1α水平。

2.6 熒光定量PCR檢測

每組取8只大鼠血液樣本,按照RNA提取試劑盒說明書方法提取RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。引物合成由上海生工生物工程公司完成,采用莖環法進行引物設計。miRNA-126-3p目的基因:上游引物5’-CGCGTCGTACCGTGAGTAAT-3’,下游引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。以U6基因為內參,上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA’,下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達水平。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 TEG檢測結果

TEG中的最大幅度指標能反映出血小板聚集功能的高低。與正常組比較,模型組大鼠TEG最大幅度明顯上升,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,蛭龍膠囊組、氯吡格雷組和聯合用藥組大鼠TEG最大幅度明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。各治療組之間比較,聯合用藥組大鼠TEG最大幅度降低最明顯,干預效果最佳(P<0.05),具體見圖1。

注:與正常組比較#P<0.05;與模型組比較*P<0.05;與聯合用藥組比較△P<0.05;血栓彈力圖(TEG)

3.2 ELISA檢測結果

與正常組比較,模型組大鼠血清TXB2水平明顯升高,6-keto-PGF1α水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,蛭龍膠囊組和聯合用藥組大鼠血清TXB2水平明顯降低,6-keto-PGF1α水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05),其中聯合用藥組大鼠6-keto-PGF1α水平上升更明顯,但與氯吡格雷組比較差異未見統計學意義,具體見表1。

表1 各組大鼠血清TXB2和6-keto-PGF1α水平比較

3.3 熒光定量PCR檢測結果

與正常組比較,模型組大鼠miRNA-126-3p水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,蛭龍膠囊組、氯吡格雷組和聯合用藥組大鼠miRNA-126-3p水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);各治療組之間比較,聯合用藥組miRNA-126-3p水平上升最明顯,干預效果最佳(P<0.05),具體見表2。

表2 各組大鼠miRNA-126-3p水平比較

4 討論

目前,西藥治療AR的效果并不理想。與西醫抗血小板藥相比,中藥來源廣、不良反應小、治療作用平和,在心腦血管疾病的防治方面具有獨特優勢[5]。例如陳品良等[6]通過網絡藥理學分析得出黃芪治療病毒性心肌炎的核心靶基因有VEGFA、AKT1等,并涉及多個生物學信號通路。賴潤民等[7]通過網絡分析技術揭示了丹參和紅花從凝血過程、炎性反應、代謝調節等多條通路和途徑改善AR的作用。AR從中醫角度辨證主要為氣虛、陰虛、痰濕、血瘀,以心血瘀阻證居多[8]。西南醫科大學附屬中醫醫院楊思進教授基于多年的中醫臨床經驗,總結出心血瘀阻證的治療應以補氣為主,破瘀通絡為輔,并在此基礎上研發了蛭龍活血通瘀膠囊,其組成包括黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物。黃芪能補氣升陽,具有固表止汗、利水消腫的功效[9];水蛭能破血逐瘀,體內外均具有抗血小板聚集活性的作用[10]。目前該藥已廣泛用于心腦血管疾病,對AR也有一定的療效[11]。本研究將蛭龍活血通瘀膠囊與氯吡格雷聯合應用對AR大鼠進行干預,觀察療效并探究相應機制,為中西醫結合治療AR提供實驗依據。

miRNA是一種小分子調節因子,其參與的轉錄調控是基因表達的重要環節。有報道顯示,一些基因及其相關的非編碼RNA的差異表達可導致不同的阿司匹林反應,說明miRNA的異常表達可能也是AR的分子機制之一[12]。血小板含有大量的miRNA,可能通過轉錄后基因調控在血栓形成和止血中發揮重要作用[13]。有學者認為,若從miRNA及其調控網絡的角度出發,探究其在中西藥共同作用下受到調控的靶基因在AR患者疾病過程中的抗病機制,可能會對AR的中西醫結合治療帶來突破[14]。miR-126是內皮細胞中表達較多的miRNA之一,其中的一條客鏈miRNA-126-3p在心腦血管疾病中發揮著重要的作用[15]。因此,本實驗通過觀察藥物對各組大鼠miRNA-126-3p的調控作用,嘗試從基因角度闡釋蛭龍活血通瘀膠囊和氯吡格雷對AR的作用機制。

TXA2作為血小板花生四烯酸的代謝產物,能夠使血管收縮,血小板聚集,從而誘發血栓形成。PGI2由花生四烯酸轉化而生成,可抑制血小板聚集、對抗血栓形成。TXA2與PGI2在體內屬于一對平衡控制體系,能反映出血管壁與血小板的相互作用關系,該平衡一旦被打破可導致血栓等心腦血管疾病,但其性質活潑,在體內不穩定,難以檢測。TXB2和6-keto-PGF1α分別是TXA2與PGI2的代謝產物,在體內水平較為穩定,便于檢測。有文獻表明,AR發生時TXB2水平會增高,而6-keto-PGF1α水平會降低[11]。本次研究結果也顯示,與模型組比較,各治療組大鼠血小板聚集率和TXB2水平降低,6-keto-PGF1α和miRNA-126-3p表達升高,提示大鼠AR有所改善,說明蛭龍活血通瘀膠囊與氯吡格雷均能通過上調miRNA-126-3p水平改善AR大鼠血小板聚集功能,并且聯合使用療效更佳。本研究結果提示miRNA-126-3p可通過降低TXB2、升高6-keto-PGF1α水平來調節血小板聚集率。但是,除了miRNA-126-3p,血小板中還有其他miRNA共同參與基因表達,它們之間的相互作用對AR大鼠血小板的聚集功能可能也會有不同程度的影響,因此僅考察miR-126-3p存在一定局限性,這也是本研究的不足之處。

綜上所述,蛭龍活血通瘀膠囊與氯吡格雷能有效降低AR大鼠血小板聚集率,且聯合用藥改善效果更佳,其機制可能與調控AR大鼠miR-126-3p的表達有關。