化痰祛濕方對肥胖型多囊卵巢綜合征大鼠的改善作用及對TGF-β/CTGF通路的影響?

岳美宏,姜大成,雷鈞濤

(1.長春中醫藥大學藥學院,長春 130117;2.吉林醫藥學院藥學院,吉林吉林 132013)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常見的內分泌疾病,臨床表現為月經不調,脫發及不孕等[1]。PCOS的發病機制至今尚未明確,目前認為激素水平失調,胰島素抵抗以及卵巢間質纖維化均與PCOS的發生密切相關[2]。西醫主要以藥物或手術為主,對于改善PCOS患者激素水平等臨床癥狀效果顯著,但后期復發率較高,因此本研究考慮中藥干預[3]。中醫認為,痰濕蘊結是肥胖型PCOS的重要病理特征,應以祛濕化痰為立法原則,化痰祛濕湯出自《證治寶鑒》卷十二,具有改善痰濕體質的功效,但作用機制尚不明確[4-5]。卵巢間質纖維化是導致PCOS的重要原因,而轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β和結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)水平與卵巢間質纖維化程度有關[6-7]。故本研究選用化痰祛濕方治療肥胖型PCOS,觀察化痰祛濕方對肥胖型PCOS大鼠卵巢組織TGF-β、CTGF的影響,以期為PCOS的治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級、SD雌性大鼠45只,體質量185～225 g,平均(205±20)g,購于北京百奧賽圖基因生物技術有限公司,實驗動物許可證為[SCXK(京)2020-0007],本研究已通過本院倫理委員會批準,倫理批準文號:2020-0175。

1.2 藥物

二甲雙胍片(國藥準字H20023371,中美上海施貴寶制藥有限公司,規格:0.5 mg);來曲唑(國藥準字H19991001,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,規格:2.5 mg)。

化痰祛濕方組方:薏苡仁30 g,澤瀉30 g,茯苓10 g,白術15 g,半夏10 g,藿香10 g,豬苓10 g,赤芍25 g,天竺黃12 g,石菖蒲12 g,蒲黃12 g,陳皮12 g[8]。所有藥材洗凈后浸泡20 min,并加入水沒過藥材,煮沸后文火濃縮至50 mL,并根據配方將生藥濃度調整為為5 g/mL,作為儲存液,使用進行稀釋,化痰祛濕方所用藥物均由本研究中心于海口市張仲景大藥房集中采購。

1.3 主要試劑及儀器

戊巴比妥鈉(CAS號:57-33-0),上海哈靈生物科技有限公司;中性甲醛(CAS號:50-00-0),北京華科盛精細化工產品貿易有限公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒(貨號:YT8310),北京伊塔生物科技有限公司;RNA提取試劑盒(貨號:FT30506yy),上海梵態生物科技有限公司;實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒(貨號:qPCR001),北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;TGF-β單克隆抗體(貨號:IBIO-17268R)及山羊抗兔二抗(貨號:IBIO-18015R),江西艾博因生物科技有限公司;CTGF單克隆抗體(貨號:A-6216-100)及山羊抗兔二抗(貨號:A-6233-100),美國Epigentek公司;SIGMA/3-18KS型臺式高速冷凍離心機,北京博勱行儀器有限公司;BS-350型全自動生化分析儀,深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司;UV-9000型紫外分光光度計,上海添時科學儀器有限公司;BT-2型電泳儀,俄羅斯Service公司。

1.4 大鼠模型建立

選用45只動情周期正常的雌性大鼠,于22 ℃,濕度50%,通風,潔凈度一萬級的環境下進行適應性飼養,所有大鼠均記錄初始體質量,隨機選取8只為對照組,進行基礎飼料喂養,其余大鼠建立肥胖型PCOS模型。除對照組外,其余組給予高脂混懸液聯合來曲唑(letrozole,LE)進行誘導,每天給予高脂混懸液15 mg/kg,同時給予LE 1 mg/kg,連續給藥28 d,給藥18 d后,每日進行陰道脫落細胞涂片,第28天記錄大鼠體質量。大鼠動情周期紊亂,同時體重增長率高于對照組即判定為肥胖型PCOS大鼠模型建立成功[9]。

1.5 分組及藥物干預

建模過程中5只大鼠建模失敗,其余大鼠隨機分為模型組,化痰祛濕方高、低劑量組及陽性組4組,每組各8只。

建模成功后,根據人與大鼠的體重及給藥劑量換算公式,陽性組給予0.3 g/kg二甲雙胍,低、高劑量組分別給予16.65 g/kg、83.25 g/kg化痰祛濕湯,對照組、模型組給予等量的氯化鈉溶液,均灌胃給藥,1次/d,連續給藥21 d。

1.6 取材

最后一次給藥后,禁食12 h,對大鼠進行體質量稱重并記錄,采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,采集大鼠股動脈血5 mL,室溫放置1 h,離心(2000 r/min,10 min,離心半徑12 cm)分離上層血清,于-80 ℃環境下凍備用。血液采集完成后迅速將大鼠處死,并于無菌環境下取出右側卵巢組織,并將周圍血管及脂肪組織分離,每組四只置于4%多聚甲醛中固定處理,用于HE染色,另外四只迅速置于液氮10 min后,于-80 ℃環境下冷凍保存,用于RT-qPCR及Western Blot檢測。

1.7 測量指標

1.7.1 大鼠血清激素水平 取5 mL上層血清,室溫解凍,采用放射免疫法檢測血清黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睪酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)水平,嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作[10]。

1.7.2 大鼠卵巢組織病理檢測 取4%中性甲醛固定的卵巢組織樣本,脫水,透明,浸蠟,包埋,制備成4 μm切片,加入染液進行HE染色,將切片置于光鏡下觀察卵巢組織病理學變化[11]。

1.7.3 RT-qPCR檢測大鼠卵巢組織TGF-β、CTGF mRNA表達情況 取部分液氮保存的卵巢組織,根據TRIzol試劑盒說明書提取卵巢組織總RNA,經逆轉錄得到cRNA,根據RT-qPCR試劑盒檢測卵巢組織TGF-β、CTGF mRNA表達。RT-qPCR反應體系:SYBR 10 mL,上游引物0.4 μL、引物0.4 μL,cDNA模板2 μL,H2O加至20 μL;反應條件:先95 ℃作用2 min;變性95 ℃ 10 s,退火58 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 10 s,循環40次[12]。GAPDH為內參基因,2-△△CT為目的基因相對定量,引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7.4 Western Blot注檢測大鼠卵巢TGF-β、CTGF蛋白表達情況

取液氮保存的卵巢組織,加入適量緩沖液研磨成勻漿,加入裂解液對卵巢組織進行裂解處理,低溫環境下離心5 min(2000 r/min,10 min,離心半徑12 cm),取上清,比色法測定蛋白濃度,并進行電泳法分離蛋白質,電泳后濕轉法轉膜,分別加入一抗TGF-β、CTGF及內參(稀釋濃度1:500),山羊抗兔二抗(稀釋濃度1:1000),經化學發光強度(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影得到結果[13]。[蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值(integral optical density,IOD)/GAPDH IOD]。

1.8 統計學方法

結果

2.1 大鼠體質量比較

與對照組比較,模型組體質量升高(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量組及陽性組體質量降低(P<0.05);高劑量組與陽性組上述指標改善效果均優于低劑量組大鼠(P<0.05),具體見表2。

表2 大鼠體質量比較

2.2 大鼠血清性激素水平比較

與對照組比較,模型組血清LH、T水平升高,FSH、E2水平降低(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量組及陽性組血清LH、T水平降低(P<0.05),FSH、E2水平升高(P<0.05);高劑量組與陽性組上述指標改善效果均優于低劑量組大鼠(P<0.05),具體見表3。

表3 大鼠血清性激素水平比較

2.3 大鼠卵巢組織病理檢測

對照組卵泡數量多,種類豐富體積大,顆粒細胞層多,卵泡生長發育良好。模型組囊狀卵泡和閉鎖卵泡數增加,顆粒細胞層減少,可見閉鎖卵泡。與模型組比較,低、高劑量組:擴張卵泡數、閉鎖卵泡數明顯減少,卵泡顆粒細胞層逐漸增厚,其中高劑量組及陽性組卵巢內可見成熟卵泡,具體見圖1。

注:黑色箭頭表示顆粒細胞層,紅色箭頭表示成熟卵泡A.對照組;B.模型組;C.低劑量組;D.高劑量組;E.陽性組

2.4 大鼠卵巢組織TGF-β、CTGF mRNA及蛋白表達量情況

與對照組比較,模型組TGF-β、CTGF mRNA水平升高(P<0.05),TGF-β、CTGF蛋白表達上調(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量組及陽性組的TGF-β、CTGF mRNA水平降低,TGF-β、CTGF蛋白表達下調(P<0.05);高劑量組與陽性組上述指標改善效果均優于低劑量組大鼠(P<0.05),具體見圖2、表4。

A.對照組;B.模型組;C.低劑量組;D.高劑量組;E.陽性組

表4 大鼠卵巢組織TGF-β、CTGF mRNA及蛋白表達量比較

3 討論

PCOS是常見的內分泌綜合征,可導致女性月經紊亂、排卵障礙,不孕不育等,半數以上的患者伴隨肥胖[14]。PCOS的病因復雜,其發生由多種因素相互作用形成,目前發病機制尚不清楚。中醫將PCOS歸屬于“月經失調”“不孕癥”及“肥胖”等范疇。其中腎虛痰濕型最為常見,主要由于脾腎虧虛導致體內水液代謝失常,形成痰濕,逐漸使卵巢表現出多囊性[15]。西醫治療PCOS短期效果顯著,但后期病情反復無法根治,目前研究證實中藥對于PCOS具有一定的療效,根據PCOS的中醫證型,本研究選用化痰祛濕方進行中藥調理,該方由薏苡仁、澤瀉、茯苓、陳皮等藥物組成,其中薏苡仁、澤瀉具有利水除濕,清熱泄熱的功效,茯苓、白術則具有健脾益氣,滲濕利水的功效;天竺黃、石菖蒲具有清熱化痰,涼心安神,化濕開胃的功效;半夏能燥濕,化痰,止嘔;藿香芳香化濕;豬苓利水滲濕;赤芍清熱涼血,散瘀止疼;蒲黃止血,散瘀,利尿;陳皮則可健脾化痰。綜合用藥該方具有健脾、化痰以及祛濕等的功效,符合脾虛痰濕型、痰瘀互結型及腎虛血瘀型等大部分類型的PCOS,旨在改善卵巢功能,促進排卵。

本研究通過建立胖型PCOS大鼠模型發現,模型組血清LH、T水平、體質量升高,FSH、E2水平降低,說明PCOS大鼠能夠導致肥胖,同時性激素水平紊亂。不同劑量的化痰祛濕方干預后,低、高劑量組及陽性組血清LH、T水平、體質量降低,FSH、E2水平升高,提示化痰祛濕方對于改善大鼠激素水平,促進排卵效果明顯,其中高劑量化痰祛濕方效果尤為顯著,提示化痰祛濕方在改善大鼠激素水平方面具有一定的效果,同時對于肥胖型大鼠的體重具有一定的控制作用。臨床藥理學顯示,天竺黃、石菖蒲、半夏及陳皮等化痰類藥物可以降低機體脂肪堆積,從而降低PCOS大鼠體重增厚卵巢細胞層,改善卵巢形態[16]。研究證實,補腎、化痰等藥方能夠有效降低機體行性激素與胰島素水平,促進排卵,半夏、天竺黃等具有化痰作用,能夠激活腺苷酸,從而進一步活化蛋白激酶α基因,使脂質代謝紊亂得到明顯的改善,因此對肥胖型PCOS起到治療作用,從而引起卵巢閉鎖卵泡數減少,卵泡顆粒細胞層增厚,PCOS的改善效果明顯[17-18]。

近年來研究證實卵巢纖維化是PCOS的發病機制之一[19]。卵巢局部產生的生物活性因子在多囊卵巢纖維化的過程有著重要作用,TGF-β,CTGF與卵巢間質纖維化密切相關。TGF-β是生物活性因子中的一種,能夠調節細胞生長、分化,同時能夠促進成纖維細胞的生長,同時,TGF-β是纖維化發生與發展的啟動按鈕,CTGF是在TGF-β的刺激下誘導產生,主要介導TGF-β的促纖維化作用,二者相互作用,加速ECM沉積,促進卵巢器官纖維化的發展,在PCOS等多種組織器官纖維化疾病中發揮重要作用[20-21]。本研究中模型組TGF-β、CTGF mRNA水平升高,TGF-β、CTGF蛋白表達上調,提示肥胖型PCOS由TGF-β/CTGF信號傳導通路誘導,化痰祛濕方干預后,TGF-β、CTGF mRNA水平降低,TGF-β、CTGF蛋白表達下調,表明化痰祛濕方對肥胖型PCOS可能通過抑制TGF-β/CTGF信號通路發揮作用?；奠顫穹侥軌蛞种芓GF-β/CTGF信號通路的表達,抑制TGF-β誘導產生CTGF,阻礙卵巢纖維化的發展,從而起到改善PCOS的作用。

綜上所述,化痰祛濕方能夠改善肥胖型PCOS,其作用機制可能與TGF-β/CTGF信號通路有關。未來可通過TGF-β/CTGF的抑制劑進一步探究該通路對肥胖型PCOS的調控作用,為化痰祛濕方在肥胖型PCOS中的廣泛應用提供更加全面的科學依據。