氧化應激環境下LncRNA MALAT1 對內皮細胞TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的影響

紀海濤，趙穎馨，于錫巧，柴強，劉振東，張叢叢

隨著老齡化加重，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發病率逐年升高，其病變部位主要是血管壁［1］。血管內壁是由內皮細胞組成的，而內皮細胞在機體器官中廣泛分布［2］；此外，其還可以充當血管壁的調劑器，釋放血管活性物質，調節血管的舒張與收縮［3］。AS的主要病因是內皮細胞對氧化低密度脂蛋白膽固醇（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的調控失衡［4］，而ox-LDL是氧化應激刺激低密度脂蛋白產生的，所以氧化應激是引發AS的重要因素。研究表明，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）與AS的發生有關［5-6］。TLR4主要分布在內皮細胞表面，其被激活后可與髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）結合，從而激活MyD88依賴的信號通路，進而促進核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活化及促炎因子的釋放［7］。

近年來長鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，LncRNA）持續受到學者們的關注，而長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄物1（long chain non-coding RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1，LncRNA MALAT1）作為LncRNA家族的一員，在細胞核中表達，具有高度保守性［8］。研究發現，LncRNA MALAT1在血管疾病中發揮作用，可以促進血管生成［9］，并且可以保護發生氧化損傷的內皮細胞［10］。但目前LncRNA MALAT1與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的關系尚不清楚。為此，本研究使用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導氧化應激細胞模型，然后探究氧化應激環境下LncRNA MALAT1對內皮細胞TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響，以期為研究氧化應激導致AS等心血管疾病的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2022年10—12月。

1.2 實驗材料 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由山東省醫學科學院提供；LncRNA MALAT1的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購自上海吉碼制藥技術有限公司：TLR4抗體購自美國Abcam公司；MyD88抗體、NF-κB抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Actin、LncRNA MALAT1、TLR4、MyD88、NF-κB的引物購自鉑尚生物技術（上海）有限公司；反轉錄試劑盒和q-PCR試劑盒購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司；蛋白凝膠購自武漢博士德生物工程有限公司；CCK-8試劑購自MCE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 將HUVEC置于含5%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的低糖DMEM培養液中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養2～3 d，待細胞貼壁且在培養皿中的覆蓋率達80%左右時進行實驗分組與處理。

1.3.2 H2O2誘導氧化應激細胞模型的最佳干預時間將HUVEC懸液接種在96孔板中（100 μl/孔），將培養板放在培養箱中預培養6～8 h，將其分為A、B、C、D組，分別使用600 μmol/L的H2O2處理0、6、8、10 h，隨后采用CCK-8法測定細胞活性，具體方法為：用PBS清洗掉殘留的培養液和H2O2，再向每孔加入10 μl CCK-8試劑與90 μl低糖DMEM培養液，將培養板置于培養箱內孵育1～4 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度。以細胞活性為60%時的時間作為本實驗的最佳干預時間，實驗獨立重復3次。

1.3.3 q-PCR檢測LncRNA MALAT1表達水平 將密度為30×104/ml的HUVEC均勻接種至6孔板中，每孔加入2 ml，培養12 h，將其分為對照組（不做任何處理）、H2O2組（使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構建氧化應激細胞模型），采用q-PCR檢測LncRNA MALAT1表達水平，具體方法為：棄去培養基，用PBS清洗1遍，加入500 μl的Trizol以提取細胞中的總RNA，將總RNA吸出并移至EP管，加入200 μl雙重去離子水（double distilled water，ddH2O），放入常溫離心機進行離心，條件為6 720 r/min、15 min（離心半徑為6 cm）；吸出上層清液（300～500 μl），加入等量異丙醇后再次離心，條件為6 720 r/min、10 min（離心半徑為6 cm）；棄去液體，用75%乙醇溶液清洗，再次離心，條件為4 480 r/min、3 min（離心半徑為6 cm）；棄去乙醇溶液后，加入ddH2O以溶解沉淀的LncRNA MALAT1。按照50 ℃ 15 min，75 ℃ 5 min的條件對提取出的LncRNA MALAT1進行反轉錄。以Actin為內參，使用PCR試劑盒對Actin、LncRNA MALAT1進行PCR擴增，加入0.4 μl上/下游引物、2.0 μl cDNA、10.0 μl PCR試劑，用ddH2O將總反應體系補齊到20.0 μl。PCR反應條件：94 ℃ 90 s，94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，共30個循環；72 ℃ 5 min。Actin的上游引物序列為5'-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3'，下游引物序列為5'-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3'；Lnc RNA MALAT1 的上游引物序列為5'-GGATTCCAGGAAGGAGCGAG-3'，下游引物序列為5'-ATTGCCGACCTCACGGATTT-3'。根據公式（ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因）計算LncRNA MALAT1表達水平。實驗獨立重復3次。

1.3.4 Western blot法檢測TLR4、MyD88、NF-κB表達水平 將密度為30×104/ml的HUVEC均勻接種至6孔板中，每孔加入2 ml，培養12 h，將其分為對照組（不做任何處理）、H2O2組（使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構建氧化應激細胞模型）、H2O2+siRNA組（轉染LncRNA MALAT1的siRNA后使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構建氧化應激細胞模型），采用Western blot法檢測TLR4、MyD88、NF-κB表達水平，具體方法為：棄去培養基，用PBS清洗1遍，加入200～300 μl RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑的混合液（1∶100），于冰上孵育5～10 min，用刮刀將細胞刮離六孔板并轉移至EP管內，每個樣本進行超聲破碎3次，5 s/次；將其轉移到4 ℃的離心機中，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為6 cm）；用移液槍吸取上清液，采用BCA法測量蛋白濃度，加入5×Buffer（與提取蛋白樣本量的比例為1∶4），置于干式恒溫器煮蛋白（100 ℃ 10 min）；添加10～15 μl的樣品并將其置于蛋白凝膠中電泳1 h，電壓保持在80 V；將蛋白轉移到PVDF膜，轉模方式為濕轉，時間1 h，電壓保持在100 V；將含有蛋白的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉90 min；用1×TBST清洗3次，5 min/次；加入TLR4、MyD88、NF-κB抗體（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶1 000），于4 ℃孵育6～8 h；于室溫下用1×TBST清洗3次，5 min/次；用相應種屬二抗孵育1 h（稀釋比例為1∶5 000），用1×TBST清洗3次，5 min/次；進行蛋白顯影，分析目標蛋白表達水平。實驗獨立重復3次。

1.3.5 q-PCR檢測TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平 將密度為30×104/ml的HUVEC均勻接種至6孔板中，每孔加入2 ml，培養12 h，將其分為對照組（不做任何處理）、H2O2組（使用600μmol/L的H2O2處理8 h以構建氧化應激細胞模型）、H2O2+siRNA組（轉染LncRNA MALAT1的siRNA后使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構建氧化應激細胞模型），采用q-PCR檢測TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平，方法同1.3.3。TLR4的上游引物序列為5'-TGGATCAAGGACCAGAGGCA-3'，下游引物序列為5'-GAGGACCGACACACCAATGA-3'；MyD88的上游引物序列為5'-AAGCGACTGATCCCCATCAAG-3'，下游引物序列為5'-TCGCAGACAGTGATGAACCTC-3'；NF-κB 的上游引物序列為5'-TCTTTGACAAT CGTGCCCCC-3'，下游引物序列為5'-CAGCCIGGTC CCGTGAAATA-3'。

1.4 統計學方法 采用SPSS Statistics 26軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2誘導氧化應激細胞模型的最佳干預時間 A、B、C、D組細胞活性分別為（1.00±0.00）、（0.77±0.05）、（0.61±0.09）、（0.52±0.04）。四組細胞活性比較，差異有統計學意義（F=40.08，P=0.001）；B、C、D組細胞活性均低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。C組細胞活性最接近60%，故H2O2誘導氧化應激細胞模型的最佳干預時間為8 h。

2.2 對照組與H2O2組LncRNA MALAT1表達水平比較H2O2組LncRNA MALAT1表達水平為（0.76±0.25），低于對照組的（1.28±0.38），差異有統計學意義（t=2.776，P=0.020）。

2.3 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平比較 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；H2O2+siRNA組MyD88、NF-κB表達水平高于H2O2組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 Western blot法檢測對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平的電泳圖Figure 1 Electropherogram of TLR4，MyD88 and NF-κB expression levels in control group，H2O2 group and H2O2+siRNA group detected by Western blot method

表1 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of TLR4，MyD88，NF- κB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

表1 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of TLR4，MyD88，NF- κB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

注：H2O2=過氧化氫，siRNA=小干擾RNA，TLR4=Toll樣受體4，MyD88=髓樣分化因子88，NF-κB=核因子κB；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05

組別TLR4MyD88NF-κB對照組0.72±0.210.41±0.140.74±0.07 H2O2組0.95±0.390.52±0.141.01±0.23 H2O2+siRNA組1.27±0.44a0.84±0.23ab1.37±0.24ab F值4.8411.5112.66 P值0.0190.0010.001

2.4 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；H2O2組TLR4、MyD88 mRNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平高于對照組、H2O2組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA expression levels of TLR4，MyD88，NFκB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

表2 對照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA expression levels of TLR4，MyD88，NFκB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05

組別TLR4 mRNAMyD88 mRNA NF-κB mRNA對照組1.09±0.050.99±0.061.02±0.04 H2O2組2.78±0.17a1.43±0.05a1.36±0.05 H2O2+siRNA組6.10±0.60ab2.52±0.11ab2.23±0.19ab F值49.5332.6426.66 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

AS是目前比較常見的心血管疾病，能夠導致血管內膜結構與功能發生變化，管壁增厚是其主要病理特點［1］。氧化應激是導致AS發生發展的主要因素之一，當內皮細胞受到氧化應激的刺激后，會引起低密度脂蛋白發生氧化，刺激黏附因子表達，導致細胞黏附性增加及細胞聚集，其還會促進NO的釋放，造成血管功能障礙［11］。同時，慢性炎癥也是造成AS加重的主要原因，研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在AS的炎癥反應中發揮著重要作用，其中MyD88作為TLR4的銜接蛋白，起著關鍵的信號轉導功能，其在接收到TLR4信號后可激活NF-κB［12］。

本研究構建氧化應激細胞模型前，首先探索合適的誘導條件。氧化應激細胞模型的誘導手段有很多，本研究選擇H2O2，因為其應用較廣泛，作用直接，性質穩定［13］。本研究結果顯示，B、C、D組細胞活性均小于A組，且C組細胞活性最接近60%，故H2O2誘導氧化應激細胞模型的最佳干預時間為8 h。

LncRNA MALAT1定位于染色體11q13.1上，首次在非小細胞肺癌中被發現，其可以調控細胞增殖，影響腫瘤的發生［14］。研究顯示，抑制LncRNA MALAT1可促進乳腺癌模型小鼠癌細胞遷移［15］。同時，LncRNA MALAT1在氧化應激引發的心血管疾病中也能發揮一定作用。LI等［16］研究發現，心肌梗死患者LncRNA MALAT1表達水平升高，LncRNA MALAT1可能成為預測心肌梗死的標志物。有研究者在高脂飲食誘導的AS模型小鼠中發現，過表達LncRNA MALAT1可以通過ox-LDL來調控Wnt/β環，從而促進AS的發生［17］。本研究結果顯示，H2O2組LncRNA MALAT1表達水平低于對照組，與CHEN等［18］研究結果類似，該研究表明，靶向敲除LncRNA MALAT1后小鼠心臟微血管內皮細胞的氧化應激反應更加劇烈。但本研究結果與RADHAKRISHNAN等［19］研究結果不同，可能是所用細胞系及干預方式不同導致的，RADHAKRISHNAN等［19］選擇的細胞系為視網膜內皮細胞，且使用高糖誘導氧化應激。

有研究者采用脂多糖誘導小鼠心肌細胞氧化應激，結果顯示，心肌細胞中TLR4、MyD88、NF-κB表達水平升高［20］。研究顯示，在中樞神經系統中，抑制小膠質細胞TLR4、MyD88、NF-κB的表達，可以減輕氧化應激，進而抑制神經元凋亡［21］。本研究結果顯示，H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達水平高于對照組，MyD88、NF-κB表達水平高于H2O2組；H2O2組TLR4、MyD88 mRNA表達水平高于對照組，H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平高于對照組、H2O2組；提示在氧化應激環境下，LncRNA MALAT1表達水平降低，進而導致TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活，這與既往研究結果［22］類似。但本研究結果與JIA等［23］研究結果存在差異，可能是采用的細胞和模擬的病理環境不同導致的，JIA等［23］使用人心肌細胞模擬心肌炎，結果顯示，下調LncRNA MALAT1可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，氧化應激環境下，LncRNA MALAT1表達水平降低，進而導致內皮細胞TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活，這為預防和治療AS提供了新的理論依據。但本研究為細胞實驗，且未進行動物實驗，后期尚需要進行動物實驗進一步驗證本研究結論。此外，LncRNA MALAT1與多種微小RNA有關，SUN等［24］研究發現，LncRNA MALAT1與miR-503位點結合后可抑制下游JAK2/STAT3信號通路的激活，本研究組后續會對此展開研究。

作者貢獻：紀海濤進行文章的撰寫、數據分析；趙穎馨、柴強、劉振東進行文章的構思與設計；于錫巧、張叢叢進行文獻的收集與整理；趙穎馨進行文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。