氧化三甲胺促進動脈粥樣硬化機制及相關防治策略

梁方圓，陸景坤，王躍武

近年隨著經濟發展和社會進步，人們的生活方式發生了明顯改變，尤其是人口老齡化和城市化進程加速，導致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）對居民健康的影響越來越大，且其發病率也越來越高［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD的病理基礎，也是造成患者死亡的主要原因。腸道菌群是廣泛分布于人體消化系統的微生物，有15 000～36 000種，約包含300萬個微生物基因，是人類基因數量的150倍［2］。研究表明，腸道菌群可以通過糖代謝和氨基酸代謝產生大量具有生物活性的代謝產物，如氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO）、短鏈脂肪酸、次級膽汁酸、脂多糖等，其像分泌器官一樣在宿主中發揮著生理作用，故腸道菌群又被喻為人體的“微生物器官”［3］，其中TMAO對AS的影響尤為突出。基于此，本研究主要綜述了TMAO促進AS的機制及相關防治策略。

1 TMAO的概述

TMAO是一種無色、無味、結晶的氧化胺類化合物，其化學式為C3H9NO，是三甲胺（trimethylamine，TMA）的氧化形式，可廣泛存在于哺乳動物、植物、真菌的小分子物質中［4］。TMAO是一種親水性、疏水性的雙組基，能夠調控蛋白質的活性和穩定性，并參與調節細胞滲透壓、維持細胞內環境穩定。近年來隨著腸道菌群研究的深入，研究者發現人體循環TMAO水平與CVD的發生、發展密切相關［5］。

腸道微生物中存在大量的膽堿TMA-裂解酶（CutC）和膽堿TMA-裂解酶激活酶（CutD），其對人體TMAO的合成具有舉足輕重的作用。CutC/D可在厭氧條件下使食物中含有膽堿或TMA結構的飲食成分（如磷脂酰膽堿、甜菜堿、L-肉堿等）的C-N鍵斷裂分解，生成TMA，而TMA進入肝臟后經黃素單加氧酶3（flavin-containing monooxygenase 3，FMO3）催化可形成TMAO，并進入體循環［6］，其中腎臟代謝是體循環中TMAO的主要清除方式。

2 TMAO與AS的關系

2.1 直接證據 動物實驗表明，TMAO能促進AS的發生、發展，如在小鼠飼料中增加膽堿類物質或TMAO后發現，小鼠體內多種巨噬細胞清除受體表達上調，巨噬細胞中的膽固醇積累增多，進而促進泡沫細胞及AS形成；而使用抗生素短期清除小鼠腸道菌群則能延緩AS的形成［7］。WANG等［8］對四組ApoE-/-小鼠分別喂食含有高膽堿類、高膽固醇類、高脂肪、高糖類食物，20周后發現，高膽堿類食物組小鼠主動脈根部有AS斑塊，且AS斑塊大小與血液循環中的TMAO濃度呈正相關；但在高膽固醇類食物組、高脂肪食物組和高糖類食物組小鼠主動脈中未見AS斑塊。GREGORY等［9］分別選擇易患動脈粥樣硬化且產生高TMAO的C57BL/6J菌株和抗動脈粥樣硬化且產生低TMAO的NZW/LacJ菌株作為供體，用于將盲腸微生物移植到ApoE-/-小鼠中，結果顯示，與以NZW/LacJ菌株為供體移植盲腸微生物的小鼠相比，以C57BL/6J菌株為供體移植盲腸微生物的小鼠在移植后隨著食用膽堿類食物增多其AS斑塊變大。

與傳統風險因素不同，TMAO可能成為一種新的心血管事件預測指標。SENTHONG等［10］通過分析穩定型冠心病患者TMAO與AS負擔的關系發現，調整傳統心血管影響因素（體質指數、藥物、病變特征、腎功能指標、超敏C反應蛋白）后，SYNTAX評分、SYNTAXⅡ評分均與血液循環中TMAO濃度呈正相關（rs值分別為0.61、0.62，P值均＜0.01），提示血液循環中TMAO濃度升高與AS負擔加重有關。

2.2 間接證據 研究表明，血漿TMAO水平與心血管疾病死亡風險存在劑量依賴性關系［11-12］。SENTHONG等［10］隨訪了2 235例穩定型冠心病患者發現，其5年死亡風險與空腹血漿TMAO水平呈正相關，高水平TMAO組死亡風險是低水平TMAO組的4倍，表明血漿TMAO水平升高預示穩定型冠心病患者死亡風險升高。TANG等［13］對521例心腎綜合征患者隨訪5年發現，心腎綜合征患者血液循環中TMAO水平明顯高于健康對照者，且伴有高水平TMAO的心腎綜合征患者死亡風險是伴有低水平TMAO的心腎綜合征患者的2.8倍。上述研究表明，血漿TMAO水平升高與心血管疾病死亡風險升高相關，這也間接證明了血漿TMAO與AS發生發展相關。

綜上，血漿TMAO與AS發生發展密不可分，但TMAO促進AS的機制目前尚處于研究階段。

3 TMAO促進AS的機制

3.1 TMAO影響膽固醇代謝 膽固醇是細胞生物膜的組成成分，能在體內轉化為類固醇類激素、膽汁酸（bile acids，BA）和維生素D。研究表明，機體僅約1/4的膽固醇來源于飲食，其余3/4在肝臟中合成［14］。膽固醇的分解和代謝也發生在肝臟中，其中大部分膽固醇可以轉化成BA，少量膽固醇通過腸道中的細菌轉化成BA并隨糞便排出，且BA是膽固醇排出的主要方式［15］。AS的發生主要因血液中膽固醇升高引起，而TMAO可以通過影響膽固醇代謝使膽固醇在血管壁堆積。

膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7-alpha hydroxylase，CYP7α1）屬于肝臟特異的微粒體細胞色素P450酶，其作用是將膽固醇分解成BA。因此，CYP7α1表達降低會間接阻止膽固醇向BA轉化，從而影響膽固醇的排出，進而使巨噬細胞中積累更多的膽固醇；而血液循環中的TMAO水平升高亦會抑制CYP7α1的表達。DING等［16］采用含0.3% TMAO的飲食喂養雄性ApoE-/-小鼠8周，采用液相色譜-質譜聯用儀檢測膽汁、肝臟、血清BA譜，采用實時熒光定量PCR檢測BA代謝相關基因的mRNA表達水平，結果顯示，與正常飲食喂養小鼠相比，接受含0.3% TMAO飲食喂養的小鼠主動脈總斑塊面積增加了2倍，且其BA譜發生了明顯改變；此外，TMAO能進一步活化核小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP）和法尼醇X受體（farnesoid x receptor，FXR），抑制CYP7α1表達和BA合成，最終導致ApoE-/-小鼠主動脈損傷。

膽固醇逆向轉運（reverse cholesterol transportation，RCT）是將肝臟外組織的膽固醇經血液循環輸送至肝臟，進而在肝細胞中合成脂蛋白、BA和類固醇激素等［17］，若RCT過程受阻則血液循環中的膽固醇及脂質蛋白濃度會升高。KOETH等［18］實驗發現，與正常小鼠相比，TMAO和高膽堿飼料組小鼠RCT能力下降35%，血漿膽固醇水平明顯升高，但肝臟和膽汁中的膽固醇水平未見明顯變化，提示TMAO可通過影響RCT和膽固醇的代謝途徑而促使泡沫細胞在血管中沉積。

3.2 TMAO促進血管炎癥反應 AS是一種典型的炎癥變質、滲出和增生。研究表明，炎癥反應貫穿AS及相關心血管事件的整個過程［19］。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是生物體內信號轉導的重要組分，其可參與介導細胞生長、發育、分裂、分化、死亡及細胞間的功能同步等多種細胞過程。MA等［20］和SELDIN等［21］研究均發現，TMAO通過多種激酶激活MAPK，而活化的MAPK可通過磷酸化轉錄因子、細胞骨架相關蛋白、蛋白激酶C等多種底物激活NF-κB通路，從而導致血管炎癥反應和血管內皮功能紊亂。楊波等［22］采用人主動脈血管內皮細胞對TMAO進行處理，采用蛋白質免疫印跡法檢測磷酸化p65蛋白入核情況，并采用實時熒光定量PCR檢測炎性細胞因子mRNA表達水平，結果顯示，人主動脈血管內皮細胞中磷酸化p65蛋白入核明顯增多，炎性細胞因子mRNA表達水平明顯升高，提示TMAO可能通過活化NF-κB信號通路而促進人主動脈血管內皮細胞分泌炎性細胞因子；而NF-κB抑制劑BAY11-7082可以抑制相應的炎性細胞因子表達，進一步表明NF-κB信號通路是TMAO激活炎性細胞因子表達的關鍵途徑。

NLRP3炎癥小體是一種由IL-1β家族細胞因子激活的蛋白復合物，可參與機體的先天免疫反應及炎癥反應，被認為是血管炎癥的關鍵參與者。研究表明，激活NLRP3炎癥小體可導致半胱天冬酶-1活化及促炎因子IL-1β和IL-18分泌增多［23］。線粒體SIRT3催化的賴氨酸去乙酰化可調控線粒體超氧化物歧化酶2（super oxide dismutase 2，SOD2）的表達，而SOD2在調節線粒體活性氧（mitochondria reactive oxygen species，mtROS）中起著重要作用，且mtROS可激活內皮細胞中的NLRP3炎癥小體［24］。CHEN等［25］通過人臍靜脈內皮細胞和ApoE-/-小鼠實驗發現，TMAO可抑制SIRT3表達，且SIRT3-SOD2-mtROS信號通路在調節TMAO介導的NLRP3炎癥小體活化中起關鍵作用［26］。此外，硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）是NLRP3的配位體，其對ROS反應靈敏。生理情況下，氧化還原酶硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）可與TXNIP結合，并對TXNIP活性產生明顯的抑制作用；隨著ROS濃度升高，TRX與TXNIP的復合物被分解，而游離的TXNIP會與NLRP3炎癥小體結合并將其激活。SUN等［24］研究發現，TMAO可有效觸發氧化應激，導致TXNIP-NLRP3炎癥小體被激活，其中炎性細胞因子IL-1β和IL-18可通過劑量和時間依賴方式被釋放，但內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和一氧化氮的合成受到抑制，提示TMAO可能通過活化ROS-TXNIP-NLRP3途徑而導致炎癥反應和血管內皮細胞損傷；此外，TMAO還可以引發巨噬細胞內質網應激反應，促進Toll樣受體被激活，從而導致炎癥反應的發生［27］。

3.3 TMAO促進巨噬細胞泡沫化 泡沫細胞作為AS的病理基礎，貫穿AS斑塊形成的整個過程。清道夫受體是吞噬細胞表面的一組異質性分子，巨噬細胞通過清道夫受體SR-A1和CD36的作用來感知和攝入氧化低密度脂蛋白，從而導致細胞內脂質沉積并形成泡沫細胞［28］。

研究表明，TMAO通過上調清道夫受體SR-A1和CD36的表達而促進巨噬細胞中氧化低密度脂蛋白的積累，從而使更多的巨噬細胞轉化為泡沫細胞［28］。MOHAMMADI等［29］分別采用TMAO和4-苯基丁酸處理小鼠巨噬細胞，結果顯示，在采用TMAO處理的不同時期小鼠巨噬細胞中SR-A1均增加，而采用4-苯基丁酸處理的小鼠巨噬細胞中SR-A1無明顯改變。此外，TMAO還可促進巨噬細胞遷移并促進炎性細胞因子（包括TNF-α和IL-6）表達，使巨噬細胞穿透內皮屏障并積聚在血管內膜，進而導致泡沫細胞的形成；再者，血漿TMAO還可以通過激活MAPK/JNK通路而增加血管細胞黏附分子1的表達，導致單核細胞黏附于血管壁，加速單核細胞向巨噬細胞轉化，進而促使泡沫細胞形成［30］。

3.4 TMAO影響血小板功能 血小板在維持血液凝固和血液循環中起著關鍵作用，如血小板功能過強則會增加血栓形成風險［31］。克利夫蘭診所的研究人員第一次證實，腸道細菌可以改變血小板功能及心臟病和卒中等血栓相關疾病的發生風險。臨床觀察性研究和前瞻性隊列研究結果顯示，血液循環中TMAO水平與血栓形成風險密切相關，在雜食動物和純素食人群中，補充膽堿或TMAO均可導致ADP依賴性血小板聚集反應增強，且血液循環中TMAO濃度與血小板反應性呈劑量依賴性關系［32］。

近期研究表明，TMAO可促進細胞內的鈣離子釋放及血小板激活，而活化的血小板會釋放不同的生長因子，如血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子、膜顆粒和細胞因子，這些因子通過促進血管平滑肌細胞增殖而參與AS的發生發展［33］。此外，TMAO還可增強血小板功能，血小板中的P-選擇素刺激單核細胞和巨噬細胞后可釋放促進血小板-單核細胞聚集的趨化因子，而血小板釋放的CD40配體可促進內皮細胞的炎癥反應。

4 基于TMAO的AS防治策略

4.1 抑制TMAO合成 TMAO不僅是AS的獨立影響因素，也是AS的治療靶點［15］。根據TMAO合成途徑，首先應該減少富含膽堿、磷脂酰膽堿或L-肉堿的食物，其次應抑制膽堿類物質向TMA轉化和TMA氧化為TMAO。

4.1.1 膳食干預 膳食干預對AS的防治具有重要意義。肉堿和膽堿是腸道微生物群依賴性生成代謝物TMAO的主要營養前體物質。研究表明，以雜食為食的人的TMAO合成能力較強，與以素食為食的人相比，其TMAO含量較高［34］。而限制飲食中的膽堿類食物攝入量是從源頭上降低TMA和TMAO的有效方法，其中魚類、牛肉等富含膽堿類物質。

4.1.2 TMA抑制劑 腸道細菌在膽堿CutC/D的作用下破壞了食物中的膽堿、左旋肉堿和甜菜堿分子中的C-N鍵，從而產生TMA。克利夫蘭醫學中心首次合成膽堿的結構類似物——3，3-二甲基-1-丁醇（3，3-dimethyl-1-butanol，DMB），其是一種廣譜的TMA抑制劑，可以通過抑制多種微生物膽堿CutC/D活性而抑制TMA的形成，進而降低血液中的TMAO含量［35］。在動物模型中，單次口服CutC/D抑制劑可有效降低血漿TMAO水平長達3 d，且無明顯的不良反應或出血事件［35］。DMB僅對TMA裂解酶有效，同時不殺滅細菌，可保留腸道菌群的其他生理功能。碘甲基膽堿和氟甲基膽堿是第二代TMA抑制劑，其不可逆、非競爭性地抑制膽堿CutC/D活性，可持續抑制TMA的產生［35］。因此，通過微生物酶抑制劑來預防和治療AS是一種新的策略。

4.1.3 其他 TMA是TMAO的前體物質，其可以通過FMO3在肝臟中的氧化作用而生成TMAO。FMO3在TMA向TMAO轉變過程中具有無可替代的作用，且在血糖和脂代謝平衡中扮演著重要角色。SHIH等［36］通過轉基因技術使小鼠的FMO3基因過表達，結果發現，小鼠肝臟和血漿中脂質均明顯增加，而使用反義寡核苷酸敲除小鼠的肝臟FMO3基因可降低血液循環中TMAO水平、血小板反應性及減慢血栓形成速率。但TMA具有強烈的魚腥味，當FMO3活性受損時會引起TMA的大量排泄，產生刺激性氣味，且會導致原發性三甲胺尿癥［37］。因此，通過抑制FMO3活性途徑治療AS的策略還有待商榷。

4.2 改變腸道菌群結構 人體的心血管健康與腸道菌群結構息息相關。腸道菌群在長期進化過程中，可在宿主和腸道菌群之間建立一個相互作用、相互依賴的系統，而服用特定抗生素、補充益生元和益生菌及糞便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，FMT）可影響腸道微生物的組成，減少合成TMAO的相關菌群，進而延緩AS進程。

4.2.1 FMT 采用FMT改變腸道微生物結構是一種可行的措施，其主要是將健康受試者的糞便內容物移植到患者的胃腸道中。KIM等［38］將動脈粥樣硬化易感（CTRP9-KO）小鼠的糞菌移植到正常小鼠體內，結果促進了正常小鼠AS的進展；反之，將正常小鼠的糞菌移植到CTRP9-KO小鼠中，則可抑制ASCTRP9-KO小鼠AS的進展。目前FMT在臨床上最常用于治療艱難梭菌感染、炎癥性腸病［39］和代謝綜合征［40］，但因存在風險（包括可能轉移內毒素或感染因子，從而引起新的胃腸道并發癥）而在臨床應用受到限制。

4.2.2 藥物 研究表明，長期使用廣譜抗生素可抑制腸道菌群生長、降低腸道微生物活性，從而降低血清TMAO水平［41］。雖然有基礎研究表明，廣譜抗生素在疾病的二級預防中具有一定作用，但由于抗生素不能識別細菌和共生菌，因此會引起許多安全問題［41］。荷蘭的一項Lifelines-Deep人群腸道菌群隊列研究分析了19種常用藥物與微生物的相關性，結果顯示，除了抗生素，許多人類靶向的非抗生素均與微生物組成改變有關，包括質子泵抑制劑、他汀類藥物、瀉藥、二甲雙胍、β-受體阻滯劑、ACEI及選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑［42］。另外，低劑量阿司匹林能降低TMAO升高所致的血小板高反應性，盡管其作用機制尚不明確，但阿司匹林可能會改變腸道微生物群落［43］。

4.2.3 益生菌/益生元 益生菌可抑制細菌生長，并與有害細菌爭奪空間和資源。益生元是一種不能被消化的物質，其能通過特殊的腸道菌群來促進有益微生物在腸道繁殖［44］。研究表明，外源性補充益生菌或益生元可以減少將膽堿分解為TMA的菌落，進而減少TMA和TMAO的產生［45］。

5 小結

腸道菌群及其代謝產物與AS的關系是近年的研究熱點，也是未來防治AS的突破口。研究表明，腸道菌群代謝產物TMAO促進AS發生［46］，其機制可能為TMAO通過影響膽固醇代謝、促進血管炎癥反應、促進巨噬細胞泡沫化及影響血小板功能等途徑而導致AS，但其確切機制仍需要進一步研究證實。同時，可通過干擾TMAO形成途徑和改變腸道菌群結構而減少TMAO生成，進而對AS起到一定防治作用。當然，從腸道菌群和TMAO方向防治AS也需要更多臨床試驗加以驗證。相信隨著宏基因組學、16s rRNA代謝組學等高通量技術的發展，TMAO促進AS的具體機制將被闡明。

作者貢獻：梁方圓、陸景坤、王躍武進行文章的構思與設計，文章的可行性分析，文獻/資料收集、整理；梁方圓撰寫、修訂論文；王躍武負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。