地方曬煙瓊中五指山-1的青枯病抗性鑒定與指紋圖譜開(kāi)發(fā)

王亞男　耿銳梅　李世斌　肖志亮　劉正文　賈振國(guó)　楊愛(ài)國(guó)　任民

摘要：鑒定抗煙草青枯病的優(yōu)異種質(zhì)資源，拓寬青枯病抗性品種的遺傳背景，提高品種抗病水平，是當(dāng)前煙草抗性育種的研究重點(diǎn)。以 Dixie Bright 101、K326、紅花大金元為對(duì)照品種，在室內(nèi)接種 FJ-SMNT、FQY-4、Y45等3株菌株，對(duì)地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查與抗性評(píng)價(jià)，并基于種質(zhì)資源重測(cè)序數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)了瓊中五指山-1的特異性 SNP 指紋圖譜。結(jié)果表明，瓊中五指山-1發(fā)病緩慢，病情輕微，病情指數(shù)增長(zhǎng)平緩，對(duì)3株菌株均有良好的抗性，抗性水平顯著高于抗病對(duì)照。構(gòu)建的特異性指紋圖譜由339個(gè) SNP 位點(diǎn)組成，基于云計(jì)算平臺(tái)開(kāi)發(fā)了該指紋圖譜的檢測(cè)程序并利用測(cè)序技術(shù)對(duì)指紋圖譜的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證，證明了該指紋圖譜可以從隨機(jī)取樣的樣品中準(zhǔn)確鑒定出瓊中五指山-1。瓊中五指山-1是目前國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的青枯病抗性最好的種質(zhì)資源之一。

關(guān)鍵詞：青枯病；曬煙；種質(zhì)資源；抗性鑒定；指紋圖譜

中圖分類號(hào)： S572.03???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A???????? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）03-0077-08

Identification of Bacterial Wilt Resistance and Fingerprint Development of Sun-cured Tobacco Qiongzhongwuzhishan-1

WANG Yanan， GENG Ruimei， LI Shibin， XIAO Zhiliang， LIU Zhengwen， JIA Zhenguo， YANGAiguo， REN Min*

（Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： The identification of excellent resistance germplasm resources to bacterial wilt， broadening the genetic background and improving the disease resistance level of tobacco varieties are the research focuses of current tobacco resistance breeding. In this study， Dixie Bright 101， K326， and Honghuadajinyuan were used as control varieties， and three Ralstonia solanacearum strains FJ-SMNT， FQY-4， and Y45 were used to inoculate tobacco plants. We then recorded the disease index and evaluated the bacteria wilt resistance of Qiongzhongwuzhishan-1， a local sun-cured tobacco germplasm resource. And based on the resequencing data of germplasm resources， the characteristic SNP fingerprint of Qiongzhongwuzhishan-1 were developed. The results showed that Qiongzhongwuzhishan-1 had a slow onset， mild disease occurence， and a mild increase in the disease index， with good resistance to all three strains. The level of resistance was significantly higher than that of the resistant control. The specific fingerprint consisted of 339 SNP loci， and a detection program for this fingerprint was developed based on the cloud computing platform. The reliability of this fingerprint was verified using sequencing technologies， and it was demonstrated that this fingerprint could accurately identify Qiongzhongwuzhishan-1 from randomly sampled specimens. The results from this study indicated that Qiongzhongwuzhishan-1 is one of the germplasm resources with the best resistance to tobacco bacteria wilt found in China.

Keywords： bacterial wilt; sun-cured tobacco; germplasm resources; resistance identification; fingerprint

青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細(xì)菌性病害，是熱帶、亞熱帶地區(qū)常見(jiàn)的毀滅性植物病害[1]。青枯菌寄主范圍十分廣泛，能夠侵染50多個(gè)科450多種植物[2]，其中茄科的重要經(jīng)濟(jì)作物煙草[3]、馬鈴薯[4]、番茄[5]、茄子[6]等均能被青枯菌侵染。煙草青枯病對(duì)世界各地的煙葉生產(chǎn)均有嚴(yán)重影響[7]。在我國(guó)，煙草青枯病主要發(fā)生在南方煙區(qū)，包括廣東、廣西、福建、湖南、四川、貴州、安徽等省份。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)煙草青枯病有從南方地區(qū)向北方地區(qū)蔓延的趨勢(shì)[8]。

種植抗病品種是防治煙草青枯病的一條經(jīng)濟(jì)有效途徑，培育抗病品種也是煙草育種的一項(xiàng)重要工作。上世紀(jì)30年代，美國(guó)率先開(kāi)展了煙草青枯病抗性育種研究，篩選到高抗水平的煙草種質(zhì)資源 TI 448A[9]。上世紀(jì)90年代至本世紀(jì)初，CORESTA （Cooperation Centre for Scientific Research Relativeto Tobacco，國(guó)際煙草科研合作中心）對(duì)多個(gè)國(guó)家代表性抗源的多年多點(diǎn)抗性鑒定表明，TI 448A 具有穩(wěn)定的抗性。并且由于 TI 448A 烤后煙葉質(zhì)量和香氣類似烤煙，因此逐漸成為了世界煙草青枯病抗性育種的主要抗源。且以 TI 448A 為親本育成的 Dixie Bright 101及其衍生品種 NC95和 Coker139等品種又成為后續(xù)一系列抗性品種的主體親本，世界各國(guó)陸續(xù)用這些品種為抗源選育了新的青枯病抗性品種[10]。我國(guó)利用的主要抗源其抗性也均來(lái)自 TI 448A，育成了巖煙97、安煙2號(hào)等抗病品種，但在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用面積較小，抗性達(dá)不到親源水平[11]。可見(jiàn)，目前所有育成品種的抗性幾乎都來(lái)自 TI 448A[12]，

導(dǎo)致現(xiàn)有抗病品種的抗源單一、遺傳背景狹窄問(wèn)題特別突出，且現(xiàn)有品種的抗性水平距離生產(chǎn)需要仍有較大差距，不能很好地起到防控青枯病的作用[13-14]。與此同時(shí)，煙草種質(zhì)資源的青枯病抗性鑒定仍不充分，高達(dá)61%的煙草種質(zhì)資源無(wú)青枯病抗性鑒定記錄，現(xiàn)有的鑒定記錄還存在時(shí)間跨度大（從建國(guó)到至今）、鑒定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、鑒定方法不精準(zhǔn)等問(wèn)題。

構(gòu)建分子指紋圖譜對(duì)保護(hù)和利用優(yōu)異種質(zhì)資源意義重大。單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms ，SNP）作為第三代分子標(biāo)記，與新一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation Sequencing ，NGS）相結(jié)合[15]，具備低成本、高效率、高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)[16]，在水稻[17]、玉米[18]、小麥[19]等主要農(nóng)作物品種的指紋圖譜開(kāi)發(fā)中得到日益廣泛的應(yīng)用。

為此，本研究擬利用青枯病苗期室內(nèi)人工接種抗性鑒定技術(shù)[20]，對(duì)前期發(fā)現(xiàn)的田間抗性良好的地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1，利用多個(gè)青枯菌序列變種進(jìn)行更加精細(xì)的抗性鑒定。以期進(jìn)一步明確該種質(zhì)的青枯病抗性水平，并基于測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)瓊中五指山-1的特異性 SNP 指紋圖譜。為應(yīng)用該種質(zhì)資源進(jìn)行青枯病抗病育種提供可靠的抗性鑒定依據(jù)，并為該種質(zhì)資源的有效保護(hù)提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試煙草品種地方抗青枯病曬煙種質(zhì)瓊中五指山-1，抗性對(duì)照品種 Dixie Bright 101（烤煙引進(jìn)品種），中抗對(duì)照品種 K326（烤煙引進(jìn)品種），感病對(duì)照品種紅花大金元（烤煙育成品種）。指紋圖譜驗(yàn)證種質(zhì)為 ZX145（雪茄煙種質(zhì)資源）、海南7 號(hào)（曬煙地方種質(zhì)資源）、中煙300（烤煙育成品種）和紅花大金元。由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)（青島）提供。青枯病高抗種質(zhì)資源 GDSY-1[21]由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.1.2 供試青枯菌菌株利用3株青枯菌菌株開(kāi)展供試材料的抗性鑒定，分別為福建菌株 FJ-SMNT （序列變種34）、貴州菌株 FQY-4（序列變種17）、云南菌株 Y45（序列變種54），均屬1號(hào)生理小種、演化 I 型、生化變種 III 型。

1.2 青枯病抗性鑒定

1.2.1 菌株活化與人工接種將用于接種的菌株解凍后，于 TTC 固體培養(yǎng)基（不含抗生素）平板上劃線，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h；挑選單菌落于NB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素）中，28℃、220 r/min 搖床中培養(yǎng)24～48 h。將培養(yǎng)好的菌懸液配制成約 OD600=0.05（約5.0×107 cfu/mL）菌懸液。煙苗培養(yǎng)至4葉 1心期時(shí)，采用灌根法人工接種10 mL 菌懸液。每個(gè)處理重復(fù)2次，每個(gè)重復(fù)6株煙苗。接菌后的煙苗置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，溫度（30±2）℃、相對(duì)濕度75%、光照12 h/d。

1.2.2 病情指數(shù)調(diào)查接種后每隔3～4 d 調(diào)查供試材料發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)。供試材料的發(fā)病等級(jí)參考孫希芳[22]方法、抗性評(píng)價(jià)參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 23222—2008[23]。

按照公式（1）計(jì)算病情指數(shù)（Disease Index， DI）。

病情指數(shù)（DI）=查總株數(shù)（發(fā)病株數(shù)）最高級(jí)代表值（該病級(jí)代表值）×100? （1）

1.3 指紋圖譜構(gòu)建

種質(zhì)資源的 GBS（Genotyping-by-Sequencing）重測(cè)序由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)（青島）提供，從中挑選了5196份煙草種質(zhì)資源的群體 SNP 分型數(shù)據(jù)。按照以下條件過(guò)濾 SNP 位點(diǎn)：（1）二態(tài)性 SNP 位點(diǎn)，（2）SNP 位于組裝后的染色體區(qū)域，（3）種質(zhì)資源群體的平均測(cè)序深度dp≥10，（4）種質(zhì)資源群體中瓊中五指山-1的測(cè)序深度dp≥10，（5）位點(diǎn)的質(zhì)量值 QUAL≥3000，（6）缺失率 miss≤0.3，（7）群體雜合率 his≤0.1；然后，利用vcftools軟件的--freq命令計(jì)算入選位點(diǎn)的等位變異頻率，并篩選稀有等位變異（minor allele）頻率Maf≤0.2的位點(diǎn)；最后，利用 Python（V 3.8.10）計(jì)算機(jī)語(yǔ)言編寫的腳本程序（下載地址： http：//47.104.13.144：8686/down/HgiSCa8dQ0Jc.py ），從上述步驟獲得的數(shù)據(jù)中，進(jìn)一步篩選滿足以下條件的 SNP 位點(diǎn)：（1）瓊中五指山-1在該位點(diǎn)是純合基因型，（2）瓊中五指山-1的等位變異屬于稀有等位變異。利用以上步驟獲得的 SNP 位點(diǎn)組成瓊中五指山-1的特異性指紋圖譜。指紋圖譜位點(diǎn)的染色體分布圖采用 MG2C 軟件[24]繪制。

1.4 指紋圖譜分析程序的開(kāi)發(fā)

利用 Python（V3.8.10）計(jì)算機(jī)語(yǔ)言，Django Web 框架（V4.0.3），基于阿里云技術(shù)開(kāi)發(fā)了瓊中五指山-1種質(zhì)資源特異性 SNP 指紋圖譜檢測(cè)程序，訪問(wèn)地址為 http：//47.104.13.144/fingerprint/qzwzs/。用戶界面如圖1所示。按照 Worku 等[25]、Povysil等[26]的方法計(jì)算遺傳距離。

1.5 指紋圖譜的驗(yàn)證

于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地溫室內(nèi)，選取海南7號(hào)、紅花大金元、 ZX145、中煙300和瓊中五指山-1等5份材料的苗期葉片組織，隨機(jī)編號(hào)后送北京諾禾致源科技股份有限公司，利用 Illumina HiSeq PE150測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端（Paired-End）150全基因組重測(cè)序（Whole Genome Sequencing ，WGS），測(cè)序深度為3X。從測(cè)序結(jié)果中，提取相應(yīng)指紋圖譜 SNP 位點(diǎn)的分型數(shù)據(jù)，利用瓊中五指山-1種質(zhì)資源特異性 SNP 指紋圖譜檢測(cè)程序進(jìn)行分析，最后分析結(jié)果與實(shí)際品種進(jìn)行核驗(yàn)，判定指紋圖譜的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 瓊中五指山-1植物學(xué)性狀

瓊中五指山-1是原產(chǎn)地為海南省瓊中黎族苗族自治縣的地方曬煙種質(zhì)資源。株型塔形（圖2），葉形長(zhǎng)橢圓，葉尖漸尖，葉面較平，葉緣波浪形，葉色綠，葉耳中，葉片主脈細(xì)，葉片較薄，莖葉角度中，花序松散、菱形，花色淡紅，種子橢圓形、淺褐色，蒴果卵圓形，株高140.3 cm，莖圍5.84 cm，節(jié)距6.91 cm，葉數(shù)14，葉長(zhǎng)47.2 cm，葉寬18.1 cm，花冠長(zhǎng)度5.03 cm ，花冠直徑1.8 cm ，花萼長(zhǎng)度1.17 cm ，千粒質(zhì)量0.17 g，移栽至現(xiàn)蕾時(shí)間48 d，移栽至中心花開(kāi)放時(shí)間57 d，全生育期148 d。

2.2 青枯病發(fā)病情況

從接種 FJ-SMNT 、FQY-4、Y45菌株后不同時(shí)間的供試材料病情指數(shù)可知（圖3），接種后28 d 是調(diào)查抗性水平的關(guān)鍵時(shí)期。此時(shí)感病對(duì)照紅花大金元的抗性評(píng)價(jià)達(dá)到感病至高感，病情指數(shù)分別為93.8、91.7、83.3；瓊中五指山-1的抗性評(píng)價(jià)均為高抗，病情指數(shù)分別為12.5、2.1、18.8；抗病對(duì)照 Dixie Bright 101的抗性評(píng)價(jià)為中抗至高抗，病情指數(shù)分別為45.8、18.8、45.8。由此可見(jiàn)，瓊中五指山-1對(duì)3株菌株均表現(xiàn)為高抗，抗性水平顯著高于 Dixie Bright 101。不同菌株間，瓊中五指山-1對(duì) FQY-4菌株抗性最好，其次為 FJ-SMNT 和 Y45。

從發(fā)病時(shí)間看，瓊中五指山-1的特點(diǎn)為發(fā)病晚，在抗病對(duì)照 Dixie Bright 101發(fā)病中期，即接種后17～21 d，瓊中五指山-1才開(kāi)始發(fā)病，且發(fā)病程度輕，多為1～2級(jí)，病情指數(shù)呈緩慢平穩(wěn)增長(zhǎng)。

2.3 SNP 指紋圖譜構(gòu)建

按照1.3中的步驟，共篩選到339個(gè)符合條件的 SNP 位點(diǎn)，標(biāo)記編號(hào)、位置信息及分型詳見(jiàn)鏈接 http：//47.104.13.144：8686/down/oPGGNMfAHFy4.do cx ，分布在參考基因組的24條染色體上（圖4），指紋圖譜 SNP 位點(diǎn)間的平均間距為23.2 Mb，在 Chr6染色體上的指紋圖譜位點(diǎn)最多，為37個(gè)。SNP 的變異類型中， A/G 轉(zhuǎn)換136個(gè)，C/T 轉(zhuǎn)換118個(gè)，G/T 顛換25個(gè)，A/T 顛換25個(gè)，A/C 顛換27個(gè)， C/G 顛換8個(gè)，其中轉(zhuǎn)換（ts）共計(jì)254個(gè)，顛換（tv）共計(jì)85個(gè)，轉(zhuǎn)換顛換比（ts/tv）為2.99。參試瓊中五指山-1群體指紋圖譜 SNP 位點(diǎn)上的基因型均為稀有等位變異，等位變異頻率從0.001到0.199，平均為0.092。

2.4? SNP 指紋圖譜的可靠性驗(yàn)證

按照1.5中的方法步驟，對(duì)瓊中五指山-1種質(zhì)資源 SNP 特異性指紋圖譜的可靠性基于測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了實(shí)際驗(yàn)證。對(duì)海南7號(hào)、紅花大金元、ZX145、中煙300和瓊中五指山-1等5份供試材料隨機(jī)編號(hào)后，進(jìn)行3X 覆蓋度的全基因組重測(cè)序。從測(cè)序數(shù)據(jù)中提取各供試材料在339個(gè)指紋圖譜位點(diǎn)上的實(shí)際測(cè)序分型結(jié)果。將數(shù)據(jù)輸入“瓊中五指山-1種質(zhì)資源特異性 SNP 指紋圖譜檢測(cè)程序”，計(jì)算上述5份材料與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種質(zhì)資源的遺傳距離，相關(guān)計(jì)算結(jié)果詳見(jiàn)表1，然后找到與種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)中瓊中五指山-1最近的供試材料編號(hào)，并將編號(hào)對(duì)應(yīng)回樣品的品種名稱。由于 WGS 測(cè)序技術(shù)的隨機(jī)性，3X 覆蓋度無(wú)法完全涵蓋供試材料的基因組全長(zhǎng)，故339個(gè)指紋圖譜位點(diǎn)，在5個(gè)樣品中實(shí)際檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)量為231～274。實(shí)際分析結(jié)果表明，利用本研究開(kāi)發(fā)的特異性 SNP 指紋圖譜，能夠有效區(qū)分瓊中五指山-1樣品與其他4份供試材料，并且與數(shù)據(jù)庫(kù)中的瓊中五指山-1遺傳距離最近。

3 討論

煙草青枯病抗性優(yōu)異種質(zhì)資源是抗病品種培育的關(guān)鍵材料，決定著青枯病抗性育種的成效和水平。相比田間病圃自然發(fā)病抗性鑒定，室內(nèi)苗期人工接種抗性鑒定具有周期短、環(huán)境可控、菌株類型明確、效率高等優(yōu)勢(shì)，非常適合種質(zhì)資源的青枯病抗性精準(zhǔn)鑒定[27]。利用人工接種抗性鑒定可以比較種質(zhì)資源對(duì)不同菌株的抗性反應(yīng)差異，對(duì)全面分析種質(zhì)資源實(shí)際抗性表現(xiàn)和適宜生態(tài)區(qū)具有重要幫助[28]。本研究對(duì)煙草地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1，在氣候室內(nèi)進(jìn)行了苗期人工接種抗性鑒定，結(jié)果表明，瓊中五指山-1對(duì)3株菌株均有良好的抗性，發(fā)病緩慢，病情輕微，病情等級(jí)增長(zhǎng)平緩。本研究所選用的3株菌株廣泛分布在我國(guó)主要煙區(qū)[29]，因此可預(yù)見(jiàn)瓊中五指山-1能夠在國(guó)內(nèi)大部分煙區(qū)表現(xiàn)出良好抗性。與目前已知的煙草青枯病抗性種質(zhì)資源 TI 448A[30]、GDSY-1[21]、反帝三號(hào)[31]、大葉密合[32]、巖煙97[33]等相比，瓊中五指山-1與 GDSY-1的抗性表現(xiàn)相近，優(yōu)于已報(bào)道的抗性品種或種質(zhì)資源[34]，是目前青枯病抗性最好的煙草種質(zhì)資源之一。

構(gòu)建 DNA 指紋圖譜是種質(zhì)資源保護(hù)與鑒定的重要技術(shù)手段[35]。分子指紋圖譜的檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展[36]，呈現(xiàn)了從人工到全自動(dòng)、從低通量高成本到高通量低成本的發(fā)展趨勢(shì)。目前煙草栽培品種的測(cè)序技術(shù)已經(jīng)十分成熟[37]，且測(cè)序成本也降到較為經(jīng)濟(jì)的水平，高通量測(cè)序在煙草上的應(yīng)用更加深入、廣泛，因此本研究選擇利用測(cè)序技術(shù)作為檢測(cè)指紋圖譜位點(diǎn)分型的技術(shù)手段。高通量測(cè)序最常遇到的問(wèn)題是由于測(cè)序的隨機(jī)性而帶來(lái)的位點(diǎn)缺失[38]。例如在本研究中，5個(gè)樣品都未檢測(cè)到全部339個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)到位點(diǎn)的比例從68.1%到80.8%，但實(shí)際分析結(jié)果證明，該指紋圖譜仍然能有效地進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定。與基于相同 SNP 位點(diǎn)鑒別大批量種質(zhì)[39] 的通用性指紋圖譜相比，本研究開(kāi)發(fā)的特異性指紋圖譜，需要預(yù)先分析每個(gè)品種或種質(zhì)的特異 SNP 位點(diǎn)，因此本研究開(kāi)發(fā)特異性位點(diǎn)分析程序（材料與方法1.3）實(shí)現(xiàn)了批量化種質(zhì)資源 SNP 數(shù)據(jù)處理，解決了特異性指紋圖譜開(kāi)發(fā)的效率問(wèn)題。綜上所述，基于測(cè)序技術(shù)的特異性 SNP 指紋圖譜為煙草種質(zhì)資源的保護(hù)與鑒定提供了高效、可靠、低成本的技術(shù)手段。

我國(guó)有豐富的曬晾煙種質(zhì)資源，在國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)保存的煙草種質(zhì)資源中，曬晾煙是數(shù)量最豐富的種質(zhì)類型[40]。瓊中五指山-1作為地方曬煙種質(zhì)資源，不適合直接用于生產(chǎn)，但作為優(yōu)異青枯病抗病種質(zhì)資源，在青枯病抗性品種培育和抗病基因發(fā)掘方面應(yīng)用前景廣闊。瓊中五指山-1的抗性水平優(yōu)異，且與烤煙主栽品種間遺傳差異更加豐富，因此十分適合作為遺傳定位群體的抗病親本。以瓊中五指山-1為供體親本，開(kāi)展抗病性狀向主栽品種的定向轉(zhuǎn)移，有希望系列化培育青枯病抗性改良品種。綜上所述，本研究鑒定發(fā)現(xiàn)的優(yōu)異種質(zhì)資源瓊中五指山-1及其特異性 SNP 指紋圖譜，為該種質(zhì)在青枯病抗性育種中的有效應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

青枯病人工接種抗性鑒定結(jié)果表明，地方曬煙種質(zhì)資源瓊中五指山-1對(duì)我國(guó)常見(jiàn)青枯菌序列變種的抗性水平為高抗，是目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的抗性最好的種質(zhì)資源之一。構(gòu)建了由339個(gè) SNP 位點(diǎn)組成的瓊中五指山-1品種特異性指紋圖譜，實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果表明，該指紋圖譜簡(jiǎn)便、高效、可靠性好，可用于瓊中五指山-1的種質(zhì)資源鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1]? JIANG G， WEI Z， XU J， et al. Bacterial wilt in China： history， current status， and future perspectives[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8：1549.

[2]? HAYWARD A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by? Pseudomonas? Solanacearum[J].? Annual? Review? of Phytopathology， 1991， 29：65-87.

[3]? LI Z， WU S， BAI X， et al. Genome sequence of the tobacco bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum[J]. Journal of Bacteriology， 2011， 193（21）：6088-6089.

[4]? OSDAGHI E. Ralstonia solanacearum （bacterial wilt of potato）[M]. CABI Compendium： CABI International， 2022.

[5]? CALDWELL D， KIM B S， TLYER-PASCUZZI A S. Ralstonia solanacearum differentially colonizes roots of resistant and susceptible tomato plants[J]. Phytopathology， 2017， 107（5）：528-536.

[6]? WICKER E， GRASSART L， CORANSON-BEAUDU R， et al. Ralstonia solanacearum strains from martinique （French West Indies） exhibiting a new pathogenic potential[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（21）：6790-801.

[7]? LI Y， FENG J， LIU H， et al. Genetic diversity and pathogenicity of Ralstonia solanacearum causing tobacco bacterial wilt in China[J]. Plant Disease， 2016， 100（7）：1288-1296.

[8]? LIU Y， WU D， LIU Q， et al. The sequevar distribution of Ralstonia solanacearum in tobacco-growing zones of China is structured by elevation[J]. European Journal of Plant Pathology， 2017（147）：541-551.

[9]? SMITH T E， EDWARD E， CLAYTON. Inheritance of resistance to bacterial wilt in tobacco[J]. Journal of Agricultural Research， 1948， 76（1）：27-32.

[10] 常愛(ài)霞，賈興華，馮全福，等.我國(guó)主要烤煙品種的親源系譜分析及育種工作建議[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2013，34（1）：1-6.

CHANG A X， JIA X H， FENG Q F， et al. Parentage analysis of Chinese flue-cured tobacco varieties and breeding suggestion[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（1）：1-6.

[11] 楊志曉，王軼，劉紅峰，等.我國(guó)主栽烤煙品種親緣關(guān)系及育種[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2013，19（2）：34-41.

YANG Z X， WANG Y， LIU H F， et al. Genetic relationship in major flue-cured tobacco cultivars in China and its implication in variety breeding[J]. Acta TabacariaSinica， 2013， 19（2）：34-41.

[12] DRAKE STOWE K， BAKAHER N， GOEPFERT S， et al. Multipledisease resistance loci affect soilborne disease resistance in tobacco（Nicotiana tabacum）[J]. Phytopathology， 2017， 107（9）：1055-1061.

[13] 劉勇，范江，李永平.煙草抗青枯病育種研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2012，18（6）：93-99.

LIU Y， FAN J， LI Y P. Research progress in breeding of tobacco resistant to bacterial wilt[J]. Acta TabacariaSinica， 2012， 18（6）：93-99.

[14] 周訓(xùn)軍，王靜，楊玉文，等.煙草青枯病研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（10）：1479-1486.

ZHOU X J， WANG J， YANG Y W， et al. Advances in tobacco bacterial wilt disease[J]. Microbiology China， 2012， 39（10）：1479-1486.

[15] HE J， ZHAO X， LAROCHE A， et al. Genotyping-by-sequencing（GBS）， an ultimate marker-assisted selection （MAS） tool to accelerate plant breeding[J]. Frontiers in Plant Science， 2014， 5：484.

[16] TORKAMANEH D， BOYLE B， BELZILE F. Efficient genome-widegenotyping strategies and data integration in crop plants[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2018， 131（3）：499-511.

[17] THOMSON M J， SINGH N， DWIYANTI M S， et al. Large-scaledeployment of a rice 6 K SNP array for genetics and breeding applications[J]. Rice （N.Y.）， 2017， 10（1）：40.

[18] XU C， REN Y， JIAN Y， et al. Development of a maize 55 K SNParray with improved genome coverage for molecular breeding[J]. Molecular Breeding， 2017， 37（3）：20.

[19] ELBASYONI I S， LORENZ A J， GUTTIERI M， et al. A comparisonbetween genotyping-by-sequencing and array-based scoring of SNPs for genomic prediction accuracy in winter wheat[J]. Plant Science， 2018， 270：123-130.

[20] 何斌彬.煙草青枯病抗病相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與抗性遺傳定位[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2020.

HE B B. Molecular markers development and mapping of tobacco bacterial wilt resistance[D]. Beijing： Chinese Academy? of Agricultural Sciences， 2020.

[21] 張振臣，袁清華，馬柱文，等.煙草品種 GDSY-1的青枯病抗性與遺傳分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2017，38（4）：9-16.

ZHANG Z C， YUAN Q H， MA Z W， et al. Inheritance of resistance to bacterial wilt in Chinese domestic tobacco cultivar GDSY-1[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（4）：9-16.

[22] 孫希芳. CORESTA 青枯病共同試驗(yàn)分學(xué)組研究報(bào)告[J].煙草科技，2001（11）：30-33.

SUN X F. Research report of CORESTA bacterial wilt common test group[J]. Tobacco Science and Technology， 2001（11）：30-33.

[23] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 23222—2008煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

General Administration of Quality Supervision， Inspection and Quarantine of the People's Republic of China， Standardization Administration of the People's Republic of China. GB/T 23222—2008 Grade and Investigation Method of Tobacco Dieases and Insece Pests[S]. Beijing： Standards Press of China， 2008

[24] CHAO J， LI Z， SUN Y， et al. MG2C： a user-friendly online tool fordrawing genetic maps[J]. Molecular Horticulture， 2021， 1（1）：16.

[25] WORKU A， TADESSE Y. A review on population structure， geneticdiversity analysis， genetic distance between population and genetic singularity in livestock[J]. Advances in Life Science and Technology， 2017， 54：1-6.

[26] POVYSIL G， HOCHREITER S. Sharing of very short IBD segmentsbetween humans， neandertals， and denisovans[J]. BioRxiv， 2014：003988.

[27] 許文，劉勇，姬廣海等.煙草青枯病苗期抗性鑒定的漂浮池恒溫水培接種法研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2013，34（2）：45-48.

XU W， LIU Y， JI G H， et al. Floating pool water inoculating method for tobacco resistance identification to bacterial wilt[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（2）：45-48.

[28] 王玉.煙草青枯病抗性的大田鑒定及苗期鑒定方法研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2018.

WANG Y. Identification of tobacco resistance to bacterial wilt in the field and study of identification method at seeding stage[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2018.

[29] 譚茜，李杰，汪代斌，等.我國(guó)主要煙草青枯病病圃青枯菌系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2022，43（2）：52-57.

TAN Q， LI J， WANG D B， et al. Phylogenetic analysis of Ralstonia solanacearum strains from the main disease identification nurseriesin China[J]. Chinese Tobacco Science， 2022， 43（2）：52-57.

[30] 周清明，黎定軍.煙草品種（系）對(duì)青枯病菌的抗性鑒定與分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996（3）：275-277.

ZHOU Q M， LI D J. The test and analysis on resistance of tobacco varietie or lines to Pseudomonas Solanacerum[J]. Jouranl of Huan Agriculture University， 1996（3）：275-277.

[31] LI Y， WANG L， SUN G， et al. Digital gene expression analysis ofthe response to Ralstonia solanacearum between resistant and susceptible tobacco varieties[J]. Scientific Reports， 2021， 11（1）：3887.

[32] 王思齊.基于 GBS 技術(shù)的煙草青枯病抗病 QTL 定位及 QTL 區(qū)域的候選基因預(yù)測(cè)[D].廣州：廣州大學(xué)，2020.

WANG S Q. QTL Mapping and candidate gene prediction for bacterial wilt resistance in tobacco using GBS Technique[D]. Guangzhou： Guangzhou University， 2020.

[33] 蘭俊榮，劉啟彤，何宏儀.部分煙草種質(zhì)資源的青枯病抗性鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2010（5）：62-63.

LAN J R， LIU Q T， HE H Y. Identification of wilt resistance in some tobacco germplasm resources[J]. Fujian Agricultural Science and Technology， 2010（5）：62-63.

[34] 何斌彬，耿銳梅，楊愛(ài)國(guó)，等.煙草青枯病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2020，41（5）：1-7.

HE B B， GENG R M， YANG A G， et al. Genome-wide association study of resistance to tobacco bacterial wilt[J]. Chinese Tobacco Science， 2020， 41（5）：1-7.

[35] ZHENG X， CHENG T， YANG L， et al. Genetic diversity and DNAfingerprints of three important aquatic vegetables by EST-SSR markers[J]. Scientific Reports， 2019， 9（1）：14074.

[36] 徐云碧，王冰冰，張健，等.應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)改進(jìn)作物品種保護(hù)和監(jiān)管[J].作物學(xué)報(bào)，2022，48（8）：1853-1870.

XU Y B， WANG B B， ZHANG J， et al. Enhancement of plant variety protection and regulation? using molecular marker technology[J]. Acta Agronomica Sinica， 2022， 48（8）：1853-1870.

[37] WANG Y， LV H， XIANG X， et al. Construction of a SNPfingerprinting database and population genetic analysis of cigar tobacco germplasm resources in China[J]. Frontiers in Plant Science， 2021， 12：618133.

[38] MINOCHE A E， DOHM J C， HIMMELBAUER H. Evaluation ofgenomic high-throughput sequencing data generated on illuminaHiSeq and genome analyzer systems[J]. Genome Biology， 2011， 12（11）： R112.

[39] YAN J， ZOU D， LI C， et al. SR4R： an integrative SNP resource forgenomic breeding and population research in rice[J]. Genom ProteomBioinform， 2020， 18：173-185.

[40] 任民，王志德，牟建民，等.我國(guó)煙草種質(zhì)資源的種類與分布概況[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（ S1）：8-14.

REN M， WANG Z D， MOU J M， et al. Overview of species and distribution of tobacco germplasm resources in China[J]. Chinese Tobacco Science， 2009， 30（S1）：8-14