不同滅菌方式、蛋白質含量飼料對大小鼠生長發育及生化指標的影響

王曉峰，徐騁昊，劉 璇，劉奕廷，張子英，張 楠，朱曉偉，韓 帥

（ 內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110 ）

實驗動物是生命科學研究的重要材料和支撐，其生命中各項生理活動均與營養緊密相關，如生長、繁殖、疾病防御等。實驗動物個體乃至群體健康均可能受到實驗動物飼料質量以及成分配比的影響，而這些影響因素很可能成為基礎研究中的復雜變量，進一步影響研究的再現性和可重復性[1]。將實驗動物飼料對動物機體的影響控制在一定可知范圍內是保證科研數據嚴謹準確的前提[2]。

實驗動物營養質量控制是實驗動物標準化的一項重要內容[2]。為標準化控制實驗動物的營養攝入，實驗動物飼料均為全價飼料。實驗動物飼料原料控制精細，嚴格按照國家標準使用規定的原料類型。但目前我國實驗動物飼料生產廠家的原料采購途徑不同，原料使用受到市場價格波動影響，而且不同廠家的飼料配方不同，同一廠家不同的產品類型，乃至不同批次的飼料成分也會存在不同程度的變化。這些變化雖然在國標范圍內，但也可能造成實驗動物機體和待測指標改變進而影響試驗結果。目前實驗動物飼料滅菌方式通常采用60Co-γ 射線滅菌和高溫高壓滅菌，而這兩種滅菌方式對飼料營養的損耗程度及飼料的熟化度、硬度等的影響也不同，均可能造成實驗動物個體差異。本試驗在60Co-γ 射線滅菌飼料和高溫高壓滅菌飼料等兩種不同滅菌條件下，選取市場上兩種不同蛋白質含量的實驗動物飼料對SPF 大小鼠生長發育和各項生化指標的進行動物健康評價，以期為確定不同滅菌方式和蛋白質含量對大小鼠健康程度的影響提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗飼料

試驗選用內蒙古地區常用的某省某公司的兩種不同鼠飼料，具體成分見表1、表2。檢測標準為GB/T 6438—2007。60Co-γ 輻照滅菌（20 kGy），高溫高壓滅菌（121 ℃、0.14 MPa、20 min）。

表1 大鼠、小鼠飼料營養水平Tab.1 Composition of feed for mice and rats

表2 大鼠、小鼠飼料氨基酸含量Tab.2 Amino acid content in rat and mice feed單位:g/kg

1.2 試驗設計

SPF 級KM 小鼠40 只，Wistar 大鼠64 只，均購自內蒙古醫科大學實驗動物中心(生產許可證號:SCXK-2020-0001；批準號:京動字8910M047），自由飲食，飼養環境符合GB-14925—2010 試驗動物環境及設施要求。21 日齡離乳后適應性飼養3 d，采用隨機分組法進行分組，KM 小鼠、Wistar 大鼠各自均分為4 組:60Co-γ 滅菌高蛋白組（CoG 組）、60Co-γ 滅菌低蛋白組（CoD 組）、高溫高壓滅菌高蛋白組（TG 組）、高溫高壓滅菌低蛋白組（TD 組），各組中Wistar大鼠為16只，KM小鼠為10只，且每組大鼠、小鼠雌、雄各半。小鼠試驗期為2021 年12 月9 日至2021 年12 月26 日，共18 d；大鼠飼養試驗為2022 年5 月16 日至2022年7月23日，共68 d。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 體重差值和臟器比

試驗第1、4、7、9、12、14、16、18 d 9:00 稱量小鼠體重，計算相鄰兩次測量的體重差值，共計8次。試驗結束后小鼠進行安樂死，解剖后取肝、腎、心臟、脾、子宮、睪丸、回腸、胃、胰腺和胸腺稱重，計算臟器指數。

試驗第1、4、7、15、23、33、47、57、68 d 9:00稱量大鼠體重，共計9次，計算相鄰兩次測量的體重差值。大鼠CO2安樂死后解剖，取肝、腎、脾、胃和胸腺稱重，計算臟器指數。

式中:m1為臟器重，m為體重，m3為后一次所測量的體重，m2為前一次所測量的體重。

1.3.2 血尿成分分析

試驗結束后剩余大鼠中每組隨機選擇10 只（雌、雄各半），麻醉取血液，2 675 r/min 離心10min，取血清，使用DI600/800 SOP 全自動生化儀（江蘇英諾華醫療技術有限公司）測試大鼠血液指標:谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰胺轉移酶（GGT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、高密度脂蛋白（HDL-C）、直接膽紅素（DBIL）、尿素（UREA）、葡萄糖（GLU）、尿酸（UA）、膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、鎂（Mg）、甘油三酯（TG）、糖化血清蛋白（FMN）、肌酐（CREA）、C反應蛋白（CRP）、前白蛋白（PA）。

試驗結束后每組隨機選取3 只雄性大鼠、小鼠進行尿液成分檢測。使用半定量尿液試紙（型號:8U12A，威海康正醫療器械科技有限公司）檢測相關指標:白細胞、亞硝酸鹽、尿膽原、蛋白質、潛血、尿比重、酮體、膽紅素、葡萄糖、抗壞血酸、微量白蛋白。操作方式參考說明書。

2022年7月24日至2022年8月11日，TG組和CoG組飼喂CoD 組飼料，之后每隔6 d 用半定量試紙測量一次尿液，記錄測試指標變化，共測試3次。指標包括:亞硝酸鹽、蛋白質、微量白蛋白。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 26.0 進行處理分析，獨立樣本T檢驗、非參數秩和檢驗進行差異顯著性分析。結果以平均值表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同飼料對小鼠、大鼠體重差值的影響（見表3、表4）

表3 不同飼料對KM小鼠體重差值的影響Tab.3 Effect of different feeds on weight difference of KM mice單位:g

表4 不同飼料對Wistar大鼠體重差值的影響Tab.4 Effect of different diets on weight difference of Wistar rats單位:g

由表3、表4可知，1～4 d和5～7 d飼喂低蛋白飼料小鼠體重差值顯著高于高蛋白飼料小鼠（P＜0.05）。其他時段體重差值差異均不顯著（P＞0.05），16 d 前高蛋白飼料飼喂小鼠體重差值低于低蛋白，16 d之后高于低蛋白。8～15 d、16～23 d飼喂低蛋白飼料大鼠體重差值顯著低于高蛋白飼料飼喂的大鼠（P＜0.05）。

飼料不同滅菌方式對小鼠體重差值無顯著影響（P＞0.05），但高溫高壓滅菌飼料飼喂的試驗鼠體重差值略高于60Co-γ 滅菌飼料；60Co-γ 滅菌飼料飼喂大鼠5～7 d、24～33 d、34～47 d 的體重差值極顯著高于高溫高壓滅菌飼料（P＜0.01）。

除1～4 d 小鼠和5～7 d 大鼠外，雄性大鼠、小鼠體重差值均顯著或極顯著高于雌性（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 不同飼料對小鼠、大鼠臟器指數的影響（見圖1、圖2）

圖1 不同飼料對KM小鼠臟器指數的影響Fig.1 Effect of different feeds on organ index of KM mice

圖2 不同飼料對Wistar大鼠臟器指數的影響Fig.2 Effect of different feeds on organ index in Wistar rats

由圖1可知，不同蛋白水平，低蛋白飼料飼喂小鼠的胰腺指數顯著高于高蛋白飼料飼喂小鼠（P＜0.05）。雄性小鼠肝臟指數、胰腺指數極顯著高于雌性小鼠（P＜0.01），胸腺指數極顯著低于雌性小鼠（P＜0.01），腎臟指數顯著高于雌性小鼠（P＜0.05）。

由圖2可知，不同蛋白水平、不同滅菌方法，大鼠臟器指數差異均不顯著（P＞0.05）；雌性大鼠胃指數、肝臟指數、胸腺指數顯著高于雄性（P＜0.05）。

2.3 不同飼料對Wistar大鼠血液指標的影響（見表5）

表5 不同飼料對Wistar大鼠血液生化指標的影響Tab.5 Effect of different feeds on blood biochemical indexes of Wistar rats

由表5可知，60Co-γ滅菌飼料飼喂的大鼠血液ALT活性和CRP的含量顯著低于高溫高壓法滅菌飼料（P＜0.05），UA、CREA含量顯著高于高溫高壓滅菌飼料（P＜0.05）。

雌鼠血液ALP 活性及TP、UREA、IgG 含量顯著高于雄性（P＜0.05），GGT活性及DBIL、TG、CRP、Mg2+的含量顯著低于雄性（P＜0.05），ALB、HDL-C、GLU、TC含量極顯著高于雄性（P＜0.01），TBA含量極顯著低于雄性（P＜0.01）。

2.4 不同飼料對小鼠、大鼠尿液成分的影響（見表6、表7）

表6 不同飼料對小鼠、大鼠尿液檢測結果的影響Tab.6 Effect of different feeds on urine test results in mice and rats

表7 轉喂低蛋白飼料后Wistar大鼠尿液成分動態變化Tab.7 Dynamic changes of urine composition in Wistar rats after being fed low protein diet單位:mg/L

由表6 可知，各組小鼠尿蛋白均為1.50 mg/L，尿微量白蛋白均為1 500 mg/L。大鼠CoG 組、TD 組、TG 組尿蛋白質分別為1.10、0.70、1.10 mg/L，尿微量白蛋白均為1 500 mg/L。大鼠CoD組尿蛋白質0.05 mg/L，微量白蛋白100 mg/L；尿膽原、GLU、維生素C均有陽性檢出。

由表7 可知，CoG 組和TG 組大鼠轉喂低蛋白飼料后第12 d 時尿蛋白質陰性，尿微量白蛋白降至300 mg/L；第18 d 時尿蛋白質陰性，尿微量白蛋白為100 mg/L；第24 d時，尿蛋白質和尿微量白蛋白均為陰性。

3 討論

3.1 不同飼料對大小鼠生長變化的影響

Sijbesma 等[3]研究表明，高蛋白飲食體重和體脂百分比低于低蛋白飲食，且高蛋白飲食可降低GPRC6a敲除和野生型小鼠的體重增加和食物攝入量[4]。本試驗中，小鼠高蛋白水平體重差值在第7 d顯著低于低蛋白水平體重差值，其余時間體重差值差異無統計學意義，高蛋白水平飼料飼喂的大鼠第7～15 d、15～23 d 的體重差值均低于低蛋白水平。這與小鼠生長變化具有一定相似性，均在生長發育的中期出現，可能是高蛋白質消化后產生大量的肽，阻斷存在于胃腸道主要血管壁上的阿片受體從而抑制食欲。同樣有研究表明，在高脂高蛋白特制飼料喂養情況下，大鼠采食量明顯下降，體重增速緩慢，出現厭食相關癥狀，且下丘腦 CCK-8 蛋白相對表達量增高，NPY 蛋白相對表達量降低[5]。

60Co-γ滅菌處理飼料飼喂的大鼠第4、23、33 d的體重差值顯著低于高溫高壓滅菌的大鼠，這可能是60Co-γ與高溫高壓對飼料中的氨基酸和維生素的破壞程度不同所致，而小鼠未出現這種情況有可能是大鼠對氨基酸和維生素的需求量更高所致。

經數據統計分析，小鼠性別方面，第1 d時雄性體重顯著高于雌性，但到第7 d 時兩者體重增長無差異，又在7 d之后顯著性逐漸增加，12 d開始差異性顯著。這可能與小鼠性別偏向表達的時間差異有關。而本試驗大鼠的生長數據統計分析，在第1 d 時，雄鼠體重明顯高于雌鼠，但第7 d兩性別體重增長無差異性，15 d之后雄鼠體重增長再次明顯高于雌鼠，生長趨勢與小鼠相同。

3.2 不同飼料對大小鼠臟器指數的影響

本試驗中，高蛋白水平飼養的小鼠的胰臟指數顯著低于低蛋白水平，其原因可能是高蛋白膳食通過破壞胰腺氧化和抗氧化平衡狀態，增加自由基對胰腺內外分泌功能的氧化應激損傷。而高蛋白水平小鼠子宮指數略低于低蛋白水平小鼠，可能是高蛋白的攝入抑制食欲從而降低采食量而導致子宮發育輕微受限。60Co-γ 滅菌處理飼料飼喂小鼠脾臟指數小于高溫高壓滅菌方法，原因可能是60Co-γ破壞了飼料中小鼠脾臟所需的物質，確定其具體原因還需進一步試驗加以驗證。

不同性別的小鼠除心臟、脾臟、肺、胃等器官的指數差異無統計學意義，雄性小鼠的肝臟、胰腺、腎臟、回腸等臟器指數均大于雌性小鼠，胸腺指數低于雌性小鼠。其中胸腺指數可能和miR-27b-3p和miR-378a-3p受雌激素所調控有關[6]，胰腺指數的差異可能和基因Slc26a9 有關[7]。而雌性大鼠的肝臟、胃、胸腺等臟器指數均大于雄性大鼠，其結果與小鼠有所不同，其具體原因還需進一步研究。

3.3 不同飼料對大鼠血液生化指標的影響

本研究中，高蛋白水平攝入的大鼠血液ALT、ALB、TBA略高于低蛋白水平，這可能是高蛋白的攝入導致機體為消化蛋白質而增加TBA的含量，進一步導致體內對氨基酸代謝增加，使ALT 活性、ALB 含量增加。有研究表明，高蛋白飲食可對肝臟的功能能力產生負面影響，導致轉氨酶活性增加，TC 和蛋白質代謝發生變化[8]。FMN 檢測可準確反映血糖水平，本研究中高蛋白日糧飼喂的大鼠血液FMN含量略高于低蛋白日糧飼喂的大鼠，表明大鼠攝取高蛋白后可使血糖升高。

由于滅菌方式會對飼料中的維生素造成破壞，本試驗中高溫高壓滅菌日糧飼喂的大鼠血液CREA 含量低于60Co-γ滅菌法，表明60Co-γ滅菌法可能使大鼠的腎臟功能下降。同時高溫高壓法滅菌日糧飼喂大鼠血液CRP、ALP、DBIL 也高于60Co-γ 滅菌法，表明大鼠肝臟功能下降，原因可能是高溫高壓破壞了某種肝臟所需的維生素成分，導致了肝臟的損傷。有試驗發現，維生素B6可在大腦衰老過程中恢復ALT的活性[9]。Haraikawa等[10]研究發現，維生素K1或維生素K2能夠提高大鼠ALP 活性。本研究中，60Co-γ 法滅菌飼料飼喂的大鼠UA 含量顯著高于高溫高壓法飼料飼喂的大鼠，可能與高溫高壓法對B族維生素的破壞有關。有研究表明，葉酸可通過降低黃嘌呤氧化酶產生氧自由基及過氧化物的能力，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而減少UA生成。而且維生素B12會加強葉酸的利用率從而降低UA的產生；同時缺乏維生素B2可能會影響到黃嘌呤氧化酶的活性，進而影響機體UA 水平；維生素B6也可參與葉酸和維生素B12的代謝從而影響UA的生成，進一步說明高溫高壓破壞維生素導致肝臟受損。本研究中，60Co-γ滅菌飼料飼喂的大鼠血液DBIL含量高于高溫高壓飼料飼喂的大鼠，原因可能是對維生素的破壞導致肝臟損傷，導致肝臟對膽紅素的代謝能力下降。綜上，這兩種滅菌方法對維生素的破壞均可對肝臟代謝產生一定影響，并且高溫高壓對大鼠肝臟的影響更大。

本研究中，雄性大鼠GGT、DBIL、TBA、CRP均高于雌性大鼠，說明雄性大鼠的代謝比雌性大鼠旺盛。本試驗中，雄性大鼠的Mg2+的濃度遠高于雌性大鼠，有研究表明，高濃度Mg2+組大鼠股骨生長速度加快，并且Mg2+能夠減輕5/6腎切除大鼠胸主動脈血管鈣化，促進骨骼生長[11]，這可能是雄性大鼠體重增長高于雌性大鼠的原因之一。雌性大鼠血液IgG含量高于雄性大鼠，研究顯示賴氨酸攝入量與大鼠血漿IgG 的分數合成率（FSR）呈正相關關系[12]，推測雌性大鼠可能對飼料中的賴氨酸更加敏感。雌性大鼠HDL-C顯著高于雄性，可能和雌激素誘導HDL-C合成有關。雌性大鼠血液UREA含量顯著高于雄性，原因可能是肝臟內UREA循環的關鍵酶（氨基甲酰-P合酶1、精氨酸-琥珀酸合酶和精氨酸酶）的表達活性與基因表達相關，通常表現為雄性因飲食而降低更為顯著[13]。雌性大鼠血液TC 含量顯著高于雄性，這可能是不同性別的大鼠對酪蛋白的敏感性不同。Torres-Villalobos 等[14]研究顯示，酪蛋白飲食大鼠的血清和肝臟TC 含量更高。雌性大鼠血液TP、ALB含量顯著高于雄性大鼠，與前人研究結果相似[15]。雌性大鼠血液GLU含量極顯著高于雄性大鼠，這可能是雌性大鼠白色脂肪組織（WAT）基因表達更活躍。Rotondo等[16]研究表明，WAT 可吸收并用于脂肪合成生成多余的膳食GLU，且雌性WAT基因表達比雄性高。

3.4 不同飼料對大小鼠尿液成分的影響

本試驗通過檢測尿液，進一步驗證不同飼料對大小鼠生長發育的影響，發現在高、低蛋白水平下小鼠均有大量蛋白尿，其尿蛋白均為1.5 mg/L，尿微量白蛋白均為1 500mg/L，并且在高、低蛋白水平下小鼠血液氨基酸成分沒有明顯差異，這表明兩種蛋白質含量可能均高于小鼠生長發育所需要的蛋白質含量，并且在一定程度上高蛋白質可能對腎臟造成損傷。同時大多數小鼠出現尿膽原陽性，其可能血膽紅素含量增高，表明肝臟出現炎癥反應，這可能是小鼠肝臟無法代謝大量蛋白質而出現肝臟的損傷。對于大鼠尿液成分檢測分析中，第一次檢測大鼠尿液后發現，高蛋白水平和低蛋白水平均有尿蛋白質和尿微量白蛋白，但其低蛋白水平不同程度的等于或低于高蛋白水平的尿蛋白含量。之后大鼠TG組和CoG組轉飼喂CoD飼料，其尿蛋白含量明顯下降，最后一次檢測其尿蛋白質和尿微量白蛋白陰性。表明TG和CoG組提供了超過大鼠所需要的蛋白質，并且可能已經對大鼠腎臟造成一定的損傷。另外，本實驗還發現從低蛋白水平飼喂大鼠的第一次檢測尿液成分中發現抗壞血酸等其他成分的陽性，這可能是一次偶然的結果，需要進一步實驗證明其結果。

本試驗發現，高溫高壓滅菌法飼喂的部分大鼠會出現尿亞硝酸鹽陽性，這可能是高溫高壓造成飼料水分不斷蒸發，硝酸鹽的濃度相對地增加并且受熱分解變成了亞硝酸鹽有關。但高溫高壓法下飼喂小鼠并沒有出現尿亞硝酸鹽陽性，可能是小鼠進食含量較小的原因，當前方法無法檢測出結果，但還需進一步證明。本研究結果顯示，飼料的滅菌方式和蛋白水平對大小鼠的健康均有不同程度的影響，應予以重視，為保證研究的準確性，可實時監測其血液和尿液相關指標。

4 結論

試驗結果表明，本試驗所用的低蛋白水平飼料比高蛋白水平飼料飼養的大鼠、小鼠更健康，60Co-γ 輻照滅菌（20 kGy）比高溫高壓滅菌（121 ℃、0.14 MPa、20 min）破壞飼料中營養成分的程度小，對大鼠、小鼠產生影響更小。