基于NK細胞的免疫治療在肝癌中的研究進展

程世紀, 匡天瑞, 董可帥, 余 佳

武漢大學人民醫院肝膽外科, 武漢 430060

原發性肝癌位于我國惡性腫瘤發生率的第4 位,腫瘤致死病因的第3位[1]。近年來,以免疫細胞為基礎的治療方案在延長肝癌患者生存期、降低癌癥轉移和復發等方面取得顯著成果。自然殺傷細胞(NK細胞)作為肝內主要的淋巴細胞,被認為是抵御肝癌的第一道防線。研究[2]表明,肝癌進展過程中存在NK細胞耗竭,而NK細胞的數量與患者生存率呈正相關,因此恢復NK細胞在肝內的數量和功能,或是一種有效的治療方法。本文綜述了NK細胞的生物學特性、肝癌中的NK細胞及基于NK細胞的免疫治療在肝癌中的研究進展。

1 NK細胞的生物學特性

NK 細胞是骨髓來源的大顆粒淋巴細胞,占外周血淋巴細胞總數的 10%～15%,在人體先天性免疫和適應性免疫中均發揮著重要作用。生理狀態下,NK細胞占肝內淋巴細胞數量的30%～50%,其中80%屬于肝內常駐NK細胞,說明NK細胞在肝臟中可能發揮著更重要的作用。人體NK細胞被分為兩個亞群,即CD56brightCD16dim和CD56dimCD16bright的NK細胞,前者主要分泌細胞因子,后者則表現出更強的細胞毒性以及抗體依賴的細胞毒作用。NK細胞被認為是抵御腫瘤的第一道防線,具有無需預先致敏、無主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)限制性等屬性[3]。NK細胞可通過穿孔素和顆粒酶的細胞毒作用、抗體依賴的細胞毒作用、分泌炎癥因子以及對外界細胞因子做出反應等發揮作用。此外,研究[4]表明,肝內常駐的CD49a+NK細胞具有記憶細胞的特點,即在反復刺激下,該細胞可以迅速激活并產生大量IFN-γ。NK細胞的功能取決于胞膜上激活受體和抑制受體與靶細胞相互作用,這些受體與特定的配體結合產生激活或抑制NK細胞的效應[5]。肝內最主要的抑制性配體是在正常肝細胞上表達的MHC-Ⅰ類分子,其可通過與NK細胞表面的殺傷細胞免疫球蛋白受體(killer cell immunoglobin-like receptor, KIR)結合,從而避免損傷正常細胞[6]。而腫瘤細胞等下調MHC-Ⅰ類分子從而躲避CD8+T淋巴細胞的殺傷,此時NK細胞因抑制信號缺失而被激活從而介導腫瘤殺傷。

2 肝癌中的NK細胞

NK細胞對肝癌的監測至關重要,然而肝癌進展過程中,盡管存在異常肝細胞MHC-Ⅰ類分子下調和NK細胞激活,肝內CD56dimCD16bright的NK細胞數量仍急劇減少,且腫瘤浸潤區域顯著少于正常區域并顯示出功能受損[7]。多種因素可導致NK細胞耗竭,其中腫瘤微環境(tumor micro environment, TME)不可或缺。TME指由周圍血管、免疫細胞、細胞外基質等構成,腫瘤發生、生長和轉移所處的環境。在腫瘤生長早期,腫瘤細胞招募和激活免疫細胞及相關基質成分形成抑瘤性炎性微環境從而阻礙腫瘤進展,而TME能夠改變局部趨化環境,優先招募細胞毒性較小的NK細胞。經過持續的抗原刺激,TME中的NK細胞逐漸耗竭而無法正常發揮作用[8]。TME中的缺氧環境、髓源性抑制細胞、吲哚胺2,3-雙加氧酶、前列腺素E2以及TGF-β等共同構成抑制性免疫微環境,進而導致NK細胞功能受抑。同時腫瘤招募的單核/巨噬細胞可通過CD48/2B4誘導NK細胞快速活化,這些NK細胞隨后疲憊并凋亡[9]。此外,腫瘤細胞可上調表面檢查點及形成可溶性激活配體從而逃避免疫殺傷[10]。通過這些方式,NK細胞抗腫瘤作用被削弱,最終導致腫瘤逃逸。研究[2]表明,外周血和肝內NK細胞絕對數量與肝癌患者的生存率及預后呈正相關,因此改善患者NK細胞的活性和數量或可有效地殺死腫瘤細胞,實現治療目的。

3 基于NK細胞的免疫治療

3.1 抗體相關療法

3.1.1 免疫檢查點抑制劑(ICI) ICI是用于阻斷免疫細胞與腫瘤細胞間的免疫檢查點,從而解除腫瘤抑制作用的單抗類藥物。ICI可通過多種方式影響NK細胞的功能,包括阻斷抑制信號、誘導NK細胞表型轉化和通過影響T淋巴細胞及Treg細胞活性間接逆轉NK細胞耗竭等。NK細胞表面的非MHC-Ⅰ特異性抑制受體如PD-1、 TIM-3、TIGIT、CD96 等被認為是經典免疫檢查點,在腫瘤浸潤的NK細胞表面不同程度的上調。其中基于PD-1的研究最為廣泛。表達PD-1的 NK細胞顯示出毒性受損及增殖能力降低等特點,而PD-1的阻斷可逆轉這些不利影響[11]。臨床研究中,PD-1抑制劑納武利尤單抗治療肝癌的安全性和有效性得到證實[12],但這并非由NK細胞主導。一項研究[13]將PD-1抑制劑與NK細胞輸注聯用,在非小細胞肺癌患者中實現了有效抗腫瘤活性,且療效優于單獨輸注NK細胞,闡明了PD-1阻斷在基于NK細胞的免疫治療的潛力。然而隨著藥物的應用,PD-1拮抗劑的耐藥性逐漸顯現。相關研究[14]表明TIM-3的上調與PD-1阻斷的耐藥性相關。肝癌患者NK細胞表達高水平的TIM-3,在與其配體半乳糖凝集素-9(Galectin 9, GAL-9)結合早期階段促進NK細胞成熟。然而TIM-3的持續高表達可中斷PI3K/mTORC1/p-S6信號從而導致NK細胞功能障礙[15]。TIM-3單獨阻斷或與PD-1阻斷相結合已展示出充分的治療潛力。

TIGIT和CD96是同一免疫球蛋白超家族的免疫檢查點,主要負責轉導抑制信號,在腫瘤浸潤的NK細胞上調。兩者作為抑制受體與激活受體DNAM-1競爭結合 CD155 ,且親和力高于DNAM-1[16],因而表現出對NK細胞的抑制作用。CD155在健康人群中幾乎不出現,而在各類惡性腫瘤中顯著表達,與TIGIT和CD96的結合可抑制NK細胞的毒性和IFN-γ的產生[17]。Sun等[18]證實阻斷TIGIT可增加外周血NK細胞對體外培養肝癌細胞的毒性,這表明靶向阻斷TIGIT或是恢復肝癌患者NK細胞功能的有效方法。此外TIGIT通常與PD-1共表達,兩者的聯合阻斷可以更有效地逆轉NK細胞耗竭。臨床研究[19]中,TIGIT抗體維博利單抗被證明具有良好的耐受性,與PD-1抗體聯合使用,在晚期肺癌患者中實現抗腫瘤活性。表達CD96的NK細胞與肝細胞癌(HCC)患者預后不良相關[18],體外研究[20]表明CD96的阻斷可促進NK細胞IFN-γ的釋放和增強抗腫瘤應答,但尚缺乏臨床證據支持。

NK細胞表面MHC-Ⅰ特異性抑制受體如KIR、NKG2A等亦是NK細胞群的典型免疫檢查點,與經典免疫檢查點在激活的NK細胞中上調不同,KIR、NKG2A等在實體腫瘤浸潤的NK細胞中穩定表達[21],介導NK細胞免疫耐受的作用不可或缺。然而研究[22]表明,KIR抑制劑及NKG2A抑制劑單藥療效有限,提示研究重點或是聯合治療方案。

3.1.2 MICA/B特異性抗體 MHC-Ⅰ類相關蛋白MICA和MICB是構成NK細胞的激活配體NKG2DL結構的一部分。正常情況下,NKG2DL僅在腫瘤組織中表達[23],并與NKG2D結合,介導機體抗腫瘤反應。然而腫瘤細胞據此產生多種逃逸機制,其中最常見的是膜結合NKG2DL脫落成為可溶性配體,后者可下調NK細胞表面NKG2D的表達,從而逃避NK細胞攻擊[24]。Ferrari等[25]據此設計了MICA/B特異性抗體7C6,該抗體掩蓋了MICA/B的α3結構域,減少癌細胞丟失細胞表面的NKG2DL并增強NK細胞的細胞毒性。Oliviero等[24]將該抗體用于肝內膽管癌患者,結果表明7C6的加入顯著促進了外周血及腫瘤浸潤區域NK細胞脫顆粒和IFN-γ的產生,為MICA/B抗體的使用提供了證據支持。

3.1.3 雙特異性抗體(BsAb)與雙特異性殺傷細胞接合劑(BiKE) BsAb是含有2種抗原結合位點的人工抗體,其中一個識別腫瘤抗原,另一個與NK細胞上CD16結合。由于CD16有不同的亞型,各亞型與抗體的親和力不同,NK細胞表現出不同的殺傷活性。BsAb中抗CD16成分可通過與CD16更強的相互作用來抵消這些差異并改善NK功能[26]。而與完整的BsAb不同,BiKE僅由兩個相互連接的可變片段組成。與其他類型的抗體相比,BiKE能夠更自由地對抗體片段進行組合,且得益于其小分子特性,BiKE具有更好的實體腫瘤穿透性[27]。綜上所述,BsAb和BiKE將腫瘤抗原與NK細胞連接起來,促進兩者形成免疫突觸,使NK細胞能夠特異性地、更加有效地發揮抗體依賴的細胞毒作用。除了BsAb和BiKE,多特異性抗體和多特異性殺傷細胞接合劑能為抗原結合提供更多選擇、更加有效地招募免疫細胞,亦值得探索。

3.2 過繼性細胞療法

3.2.1 自體或同種異體NK細胞移植 自體NK細胞輸注因治療風險低且無后期免疫抑制的需要而最先受到關注。然而輸注的細胞雖然能夠在體內擴增,但因輸注前采集和預處理對NK細胞功能的影響以及MHC-Ⅰ類分子的抑制作用,過繼的NK細胞無法對腫瘤產生有效作用,同種異體NK細胞成為新選擇。同種異體NK細胞表面KIR與宿主細胞的MHC-Ⅰ不匹配,因而可以被激活。然而由于原代NK細胞的分離和純化存在困難,NK-92細胞系、臍帶血(umbilical cord blood, UCB)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)來源的NK細胞逐漸受到關注。目前應用最廣泛的是來源于非霍奇金淋巴瘤患者外周血的克隆細胞系NK-92。NK-92屬CD56brightCD16dim的NK細胞,可高表達穿孔素和顆粒酶B,具有高度的細胞毒性[28]。NK-92表達許多激活受體,包括NKG2D、NKp30、NKp46和2B4,而缺乏除KIR2DL4和CD94/NKG2A以外的大多數抑制受體,使得NK-92細胞的激活得到保障[29]。在良好操作規范條件下,NK-92細胞可大量擴增使其成為過繼細胞的良好選擇。臨床研究[30]表明,NK-92細胞用于過繼細胞治療是安全的,在晚期癌癥實驗中沒有出現嚴重的不良反應并在各類腫瘤模型中顯示出治療潛力。然而NK-92在體內擴增困難,且由于輸注前γ射線照射導致其持久性不足等問題使其無法發揮最大療效。宿主體內的單個核細胞可靶向裂解NK-92細胞,進一步降低了其在體內的存活率,部分研究[31]表明與IL-15共同給藥似乎能緩解這種排斥反應。此外NK-92細胞高度依賴IL-2,而IL-2的重復注射會帶來諸多不良反應。NK-92細胞的變體NK-92MI和NK-92CI細胞,通過基因改造使其表達hIL-2cDNA以合成內源性IL-2或是一種有效方法。目前,如何保證NK-92細胞在體內的持久性和功能性是該療法應用的關鍵問題。

3.2.2 嵌合抗原受體NK (CAR-NK)細胞 CAR-NK細胞是指將含有抗原識別結構域及激活信號的基因引入NK細胞并表達,使其能與特定腫瘤抗原結合而被激活的治療方法。隨著CAR-T淋巴細胞在治療上取得一定成果,其局限性如MHC限制性、移植物抗宿主反應、脫靶效應、神經毒性和細胞因子釋放綜合征等隨之顯現[32]。NK細胞無需預先致敏、無MHC限制等特性,使得CAR-NK細胞可潛在地克服CAR-T淋巴細胞現有的不足,成為過繼治療的新選擇。此外多項臨床試驗[33]表明,NK細胞比基于T淋巴細胞的療法具有更安全的特征。基于CAR的候選靶標包括:磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3, GPC3)、NKG2D、AFP、上皮細胞黏附分子、細胞間質上皮轉換因子、CD147等。其中GPC3是一種在正常肝臟細胞不表達,而在肝癌組織過度表達的糖蛋白。Yu等[34]開發了GPC3-CAR-NK-92細胞并證明其可有效殺傷肝癌細胞。Zhao等[35]在此基礎上對CAR進行優化,開發出包含CD8α鉸鏈區域和4-1BB跨膜結構域的GPC3-O4-CAR,后者可以在NK細胞表面高效、穩定地表達,且具有該結構的NK細胞表現出更強的細胞毒性并可以分泌更多IFN-γ。Tseng等[36]以CD147為靶抗原,開發了用于治療HCC的CD147-CAR-NK細胞并證實該細胞可有效殺死多種肝癌細胞系和抑制PDX小鼠模型中肝癌的進展。該研究在此基礎上進一步探索了GPC3-synNotch誘導的CD147-CAR-NK細胞來減輕腫瘤外毒性,此時的NK細胞僅對高表達GPC3的肝癌細胞表現出殺傷活性。

除了引入CAR,從過繼細胞中去除負調節因子亦是基因改造的一種選擇。由CISH基因編碼的細胞因子誘導的SH2蛋白(cytokine-inducible SH2-containing protein, CIS)是NK細胞內IL-15信號傳導的關鍵負調節因子。通過去除NK細胞中的CIS進行代謝重編程,可提高其在體內的持久性和抗瘤活性,增加由IL-15介導的JAK-STAT通路信號傳導活性,進而刺激NK細胞增殖[37]。CD38也被認為是NK細胞的負調節因子,表達CD38的NK細胞持久性降低并易受到氧化應激的影響。通過敲除NK細胞中的CD38相關基因,與CD38抗體協同作用,可改善多發性骨髓瘤患者體內NK細胞的持久性并增強抗體依賴的細胞毒作用[38],為增強NK細胞活性提供另一種選擇。

然而,該療法尚面臨未解決的難題,其中最主要的便是NK細胞的擴增困難和體內持久性不足。可用于表達CAR的NK細胞有多種來源,其中iPSC來源的細胞有望解決這一問題。iPSC指由數個重編程基因導入體細胞并逐步誘導獲得的,具備無限增殖和多向分化能力的人造胚胎干細胞。iPSC可進行精確的基因修飾,有效地分化以產生成熟的NK細胞即iPSC-NK細胞。與其他來源的NK細胞相比,iPSC-NK細胞更易以可靠的方式進行基因改造,且具有更強的抗癌活性,是基因工程細胞的合適來源[30]。目前已有iPSC-NK細胞用于臨床試驗,包括與ICI聯合治療難治性實體瘤以及對CD16高親和力的iPSC-NK細胞,有望為iPSC-NK細胞的臨床應用提供證據支持。此外,該療法應用的另一障礙是缺乏合適的引入CAR的載體。最近的研究對離體擴增的人NK細胞慢病毒轉導系統性改進后,轉導效率為26%～61%[39],或是產生大量基因修飾NK細胞的有效方法。

3.3 細胞因子 正常肝臟中富含的細胞因子對NK細胞的成熟和活化至關重要,其中IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ表現出對NK細胞的促進和激活作用,而其他細胞因子如IL-6、IL-10、TGF-β則直接或間接抑制NK細胞。在有積極作用的細胞因子中,具有調節免疫系統、促進免疫細胞生長、分化等作用的IL-15最受關注。肝癌進展過程中,細胞因子的產生存在免疫規避性抗炎反應,表現為肝內抗炎因子IL-10和TGF-β表達的上調,進而導致各類免疫細胞功能受抑[40]。研究[41]表明,IL-15可增強暴露于肝癌后NK細胞的功能,提示了IL-15的治療潛力。而與其他細胞因子相比,IL-15更具有維持NK細胞持久性、恢復線粒體完整性、減少細胞凋亡等功能及更低的毒副作用[42]。目前已經設計了幾種重組形式的IL-15,如hetIL-15、IL-15“超級激動”劑N-803等,并在臨床前研究中取得良好效果。然而IL-15長期使用已被證實可通過表觀遺傳重編程機制導致細胞周期停滯、活力和溶解活性降低等不利影響[43]。IL-2、IL-21對NK細胞亦有積極作用,其中IL-2因其毒性作用導致應用受限。值得關注的是IL-21可以激活STAT1和PI3K-AKT-Foxo1通路從而逆轉TIM-3和PD-1介導的NK細胞耗竭,與其他細胞因子如IL-15的組合可增加NK細胞增殖和IFN-γ的產生[44],提示細胞因子的組合或將取得更佳療效,同時細胞因子聯合其他療法比單獨應用獲益更多。

4 總結

隨著人們對NK細胞研究的深入,以及免疫學、基因工程技術等發展,NK細胞作為腫瘤治療主力軍成為可能。同基于T淋巴細胞的治療相比,NK細胞在功能性、安全性等方面顯示出優勢。相關研究表明,基于NK細胞的治療取得可喜成果,但也必須正視這些治療方法帶來的挑戰,進一步探索兼顧安全性和有效性的治療方法。目前,盡管該療法尚處在起步階段,但仍應堅信基于或聯合NK細胞的治療能在未來肝癌治療中占據一席之地。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明:程世紀負責查找文獻,撰寫文章;匡天瑞、董可帥負責修改文章;余佳負責指導撰寫文章并最后定稿。