飲用水的微生物污染研究現狀

許景成，徐知明，張玉娟

（深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518102）

隨著人們物質生活水平的日益提升和媒體對食品安全問題的頻頻曝光，消費者對食品安全越來越關注，而飲用水安全作為食品安全的重要組成部分，應引起相關部門的重視。根據世界衛生組織的一項調查，飲用水與全球80%的疾病有關，每年約有1.2 億人因飲用水污染和衛生條件惡劣而患病。此外，飲用水污染會導致霍亂、腹瀉、甲型肝炎、傷寒和小兒麻痹癥等傳染性疾病的爆發。我國仍有2.8 億人使用受污染的飲用水[1]。水源水從凈化到使用的過程時間長，極易受到微生物的污染，易導致感染性腸道疾病。

1 飲用水的微生物污染研究現狀

致病性微生物污染問題是目前食品行業最大的食品安全問題。在我國，多數食品中毒由致病性微生物引起。近年來，各食品生產企業的調查研究顯示食品微生物污染的源頭首先指向飲用水[2]。國家市場監督管理總局、國家標準化管理委員會聯合頒布的《生活飲用水衛生標準》（GB 5749 —2022）基于我國近些年的飲用水監測、檢測和調查數據，在國內外關于污染物健康效應最新研究成果的基礎上，采用了健康風險評估的技術方法，同時考慮了我國的實際情況和管理要求，修訂了飲用水的監測指標和限量值，水質指標數量從106 項調整到97 項，其中常規指標43 項、擴展指標54 項，微生物指標增至6 項，增加了大腸埃希氏菌、耐熱大腸菌群、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲指標，要求不得檢出總大腸菌群和大腸埃希氏菌，菌落總數不得超過100 CFU·mL-1[3]。

飲用水的質量安全問題一直是國內外關注的焦點。當前飲用水的質量主要與化學風險和微生物風險有關，化學風險主要包括一些重金屬（如砷、鉻、氟、鉛）、硝酸根離子、總可溶性固形物和一些有機污染物。世界衛生組織制定的《飲用水水質準則》中指出，與化學風險相比，微生物風險是飲用水安全的主要問題，應該作為關注重點[4]。然而國內對飲用水的檢測多聚焦于礦物質元素含量、農藥殘留、消毒副產物殘留和有機物含量等的檢測，對于飲用水中微生物的檢測技術與方法的研究略有缺乏。

2 致病微生物的危害

飲用水污染常見的致病微生物有銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、嗜肺軍團菌和分枝桿菌等。其中銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及霍亂弧菌為飲用水常測指標。

2.1 銅綠假單胞菌的危害

銅綠假單胞菌可通過水源、土壤、器皿和接觸等方式傳播，是水質污染的指示菌，對化學試劑的抵抗力比普通革蘭氏陰性菌強，具有多重耐藥特征，感染率較高。銅綠假單胞菌含有多種毒力因子，主要包括多種外毒素（綠膿素、黏附素和肉毒素等）和內毒素等致病因子，該菌可以感染多種身體組織或器官，如皮膚和軟組織、血液系統和呼吸系統。銅綠假單胞菌是一種食源性致病細菌，可引起急性腸道疾病和皮膚炎癥[5]。

2.2 腸道病原體的危害

在水源中傳播的病原體中，腸道病原體（如大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌）是最常見的病原體，人類常通過攝入受污染的水和食物而感染。據報道，致病性大腸桿菌在地下水源中的流行比在地表水源中更加廣泛；霍亂弧菌在地表和地下水源中均存在，這些腸道細菌是各種疾病及其并發癥的病原體。

大腸桿菌產生的內毒素、黏附素以及腸毒素等均可能導致腹瀉，感染嚴重者可能伴有溶血尿毒綜合征，有致命的危險，其危害較大，可用于監測飲用水源和再生加工用水水質。沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，是全球細菌性胃腸炎的主要病因之一。沙門氏菌的致病性是大量毒力相關因子相互作用的結果，主要有毒力島毒力因子、質粒毒力因子、結構性毒力因子（包括菌毛和鞭毛）、腸毒素毒力因子等[6]。霍亂弧菌是革蘭氏陰性菌，其對營養的要求不高，但對環境因素比較敏感，如對熱、干燥、日光和常用消毒劑等較為敏感[7]。產毒素霍亂弧菌現被認為是許多水體環境中低等植物區系原來存在的成員，可長期存活并繁殖而不失去毒力決定簇。研究表明，在霍亂流行期間，水生環境可能是霍亂弧菌的來源，霍亂弧菌可產生腸毒素，人們攝入含有霍亂弧菌的飲用水后，可引起霍亂的暴發[8]。

3 飲用水中一般微生物的常見檢測

細菌數量的增加是生物安全風險上升的明顯標志，可以用特定細菌、細菌群或總細菌群落的變化來衡量。特異性檢測傳統上是在選擇性培養基上進行培養。傳統培養法是基于對純培養物的分離，并通過對分離物的形態、代謝和生化特征進行鑒定，或通過顯微鏡檢查等更簡單的染色反應來鑒定具有某種特性的細菌。傳統方法有濾膜法、多管發酵法、酶底物法、免疫磁分離熒光抗體法。隨著分子生物學技術的發展，熒光技術與流式細胞術、高通量測序等方法也逐漸被應用到微生物的檢測中。

3.1 傳統檢測技術

3.1.1 濾膜法和多管發酵法

濾膜法適用于雜質含量較少的飲用水檢驗，操作簡單，但檢驗準確率相對較低。多管發酵法適用于不同類型飲用水樣本的檢驗，該方法主要采用最大可能數法對微生物檢驗情況進行表示，有利于監測總大腸菌群密度情況，以及對水質安全性進行評定。多管發酵法對飲用水中某些微生物（如大腸桿菌、雜菌與耐熱大腸菌群）的檢出率比濾膜法更高，但多管發酵法的操作步驟復雜、檢測時間長[9]。

3.1.2 酶底物法

酶底物法常用于檢測大腸埃希氏菌，在選擇性培養基中以β-半乳糖苷酶誘導細菌釋放色原體，使培養基呈現顏色變化，再用分光光度計測得的OD值變化檢測水中的總大腸菌落。

3.1.3 免疫磁分離熒光抗體法

免疫磁分離熒光抗體法適用于飲用水中賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊（簡稱“兩蟲”）的測定。由于“兩蟲”的體積小，耐氯性強，且在水環境中孢囊和卵囊的存活期和潛伏期均較長，常規方法無法將其滅活，導致其存在水平較高。因此，常采用Filta-Max 法過濾、淘洗、濃縮、免疫磁珠分離、免疫熒光分析和微分干涉鏡檢等技術進行分析和檢測，具有過濾速度快，回收率高且穩定的特點，但成本費用較高，操作步驟煩瑣，加上“兩蟲”的傳染性高，需要研究人員熟練操作。

3.2 新發展技術

傳統培養方法可檢測出的微生物數量僅占總數的0.1%，大部分微生物無法依靠培養的方式獲得。傳統培養法具有操作煩瑣、耗時長等弊端。因此，為更加深入地了解飲用水中的微生物群落結構并探究不同群落間的相互作用，必須依靠更加先進的分子生物學工具。在培養、血清學和分子方法等診斷技術中，分子方法診斷速度最快，且具有高靈敏度、特異性和安全性。

3.2.1 熒光技術與流式細胞術

基于熒光染色的流式細胞術是流式細胞術根據熒光測量快速表征和定量不同的菌群，通過檢測特定波長范圍的通道測量熒光強度，可快速針對懸浮于液相環境中的單個細菌或微球進行多參數定性和定量分析，以實現細菌的絕對計數與不可培養計數。該技術現已被廣泛應用于微生物學研究中，如對微生物污染的水進行細菌的快速計數、聯合使用熒光染色的特異性配體鑒別目標細菌、通過制備配體功能化微球建立多重檢測方法等。

3.2.2 高通量測序

高通量測序技術可分析復雜細菌群落。應用該技術可實現一次并行并對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，從而對樣品進行分類學鑒定，并提供有關微生物群落結構的詳細定性和定量信息。該方法也可用于研究飲用水中的細菌多樣性和豐度，以觀察微生物群落變化、檢測致病菌、觀察生物膜的形成與變化等。該法靈敏度較高，是對傳統測序技術的一次革命性變革[10]。

3.2.3 PCR 技術

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是檢測各種樣品中多種微生物的最廣泛使用的分子方法之一。水是傳播沙門氏菌、霍亂弧菌和大腸桿菌等致病菌的來源之一，PCR 技術因其快速、特異、靈敏、需樣品量少等優勢被廣泛應用于檢測和鑒別水中的沙門氏菌、霍亂弧菌和大腸桿菌等。

4 飲用水中VBNC 狀態細菌的檢測

飲用水中的細菌可在消毒等因素誘導下進入活的不可培養（Viable But Non-Culture，VBNC）狀態。VBNC 狀態的細菌可在適當的條件下復蘇，對飲用水安全造成危害。例如，當外界環境不利于生長時，霍亂弧菌會進入VBNC 狀態，此時霍亂弧菌無法在培養基上進行細胞分裂而生長，但其代謝活動仍在繼續，并且仍可以致病[11]。

普通的直接活菌計數法無法檢測到VBNC 狀態的細菌，導致測得細菌總數偏低。使用抗生素作用于VBNC 細菌，由于其具有的抗生素耐受性，使其伸長，可在顯微鏡下篩選讀數，但此方法存在特異性、靈敏度較低等缺點。目前，常用單疊氮丙啶-熒光定量PCR、反轉錄熒光定量PCR 與應用最大或然數聯用、流式細胞儀技術和適宜的細胞活性染料、5-氰基-2,3-二聚氯四唑聯合流式細胞術和D2O 標記拉曼光譜聯用等技術測定不同活性狀態下的細菌數量和濃度[12-13]。

5 結語

我國飲用水微生物污染問題仍然存在，亟待解決。相關部門應重視并加強監督監測，結合我國的水源水質風險、水質凈化和水質檢驗技術水平、污染物健康效應等制定飲用水水源標準，強化源頭管控要求，提高飲用水衛生保障水平，保障食品安全。