臭氧處理對洞庭青鯽魚肉揮發性成分的影響

王伯華,王美焱,王晨曦,雷頌*

1(湖南文理學院 生命與環境科學學院,湖南 常德,415000)2(省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室魚類健康養殖分中心,湖南 常德,415000)(環洞庭湖水產健康養殖及加工湖南省重點實驗室,湖南 常德,415000)

洞庭青鯽(Carassiusauratusvar.Dongting)是近年來在洞庭湖區澧水北民湖水域發現的天然二倍體鯽新品系[1],屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprininae)鯽屬(Carassius),在我國洞庭湖區廣泛分布,是湖南水域特有的魚類資源。洞庭青鯽與其他種鯽魚及同水域的彭澤鯽相比,具有生長速度快,肌肉含量高,蛋白質含量高,氨基酸種類齊全,味道鮮美等優勢,經濟效益顯著[2-3]。

水產品的腥味一直是影響其品質和消費的關鍵因素。其腥味物質并不是單一物質,是由多種揮發性物質共同作用而成,主要有醛類、醇類、烴類、酮類、萜烯衍生物以及少量的硫醚、呋喃、萘類等[4]。隨著消費水平的提高,人們對食品風味的要求也不斷提高,而腥味嚴重限制了水產品的加工應用。目前,水產品的脫腥方法[5-6]主要包括物理脫腥法、化學脫腥法、生物脫腥法和感官掩蔽脫腥法等[7]。化學法中的臭氧脫腥法在水產品中的研究與應用越來越廣泛,臭氧具有強氧化性,能夠在水中產生極活潑的單原子態氧和羥基自由基,可氧化水中的還原性物質,同時與一些有機物發生反應,改變腥味物質的結構,生成腥味閾值更大或無腥味的物質,從而實現脫腥[4,8]。臭氧還具有殺菌和脫色作用,降低腥味的同時能提高魚肉白度,改善魚肉的質構特性和持水能力等特點[8-9],此外,臭氧作用后可分解成氧氣,應用于食品中較為安全和高效。周鴻宇等[10]發現與傳統漂洗相比,使用臭氧氣浮漂洗鰱魚糜可有效減輕魚糜腥味。杜國偉[11]發現臭氧處理可有效減輕或脫除35種以上鰱魚魚糜中的揮發性成分,提高鰱魚魚糜品質。

目前,關于洞庭青鯽在腥味物質分析及脫腥方面的研究較少。因此,本試驗以洞庭青鯽為研究對象,采用頂空固相微萃取結合氣質聯用法(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)結合氣味活度值(odor activity value,OAV),通過偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)系統研究臭氧處理的脫腥效果,為提高洞庭青鯽的食用品質提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活洞庭青鯽,體重0.5～1.0 kg左右,由本實驗室提供;NaCl、無水乙醇,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;2,4,6-三甲基吡啶標準溶液,Sigma公司。

1.2 儀器與設備

OGP-YDZ10G型臭氧發生器,廣州奧普發環保科技有限公司;XH-C型旋渦混合器,常州越新儀器制造有限公司;PL203型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;7890B-5977型氣相色譜質譜儀,安捷倫科技有限公司;50/30 μm CAR/PDMS/DVB固相微萃取頭,美國Supelco公司;Multifuge X1R型高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

鮮活洞庭青鯽去內臟、去鱗、去頭、去尾,清洗干凈后去皮剔骨采肉,按料液比1∶5(g∶mL)加蒸餾水漂洗3次,4 ℃、5 000 r/min離心10 min后去上清液,即得試驗樣品。

1.3.2 臭氧脫腥處理

向0～4 ℃蒸餾水(pH自然,約為7)中通入臭氧20 min,制得質量濃度約為2.5 mg/L的臭氧水。取一定質量的洞庭青鯽魚肉樣品,按料液比1∶3(g∶mL)加入上述臭氧水,分別浸泡5、10、15、20 min,浸泡處理的同時持續通入臭氧,以維持臭氧濃度。未經臭氧處理的樣品記為浸泡0 min。處理后各樣品于4 ℃、5 000 r/min離心10 min后去上清液備用。

1.3.3 感官評定標準

參照杜國偉[11]的綜合評分法進行改良,將脫腥前后的樣品由10名(5男5女)經培訓的食品專業學生根據感官評定標準進行感官評分,腥味評分為0～5分,無腥味記5分,腥味很輕記4分,腥味較輕記3分,腥味一般記2分,腥味較重記1分,腥味極重記0分。得分取平均值,結果以平均值±標準偏差表示。

1.3.4 揮發性成分分析方法

樣品前處理:稱取3 g洞庭青鯽魚肉,加入0.15 g NaCl并攪勻,轉至15 mL頂空瓶中,添加33 μL的內標物(采用乙醇稀釋的2,4,6-三甲基吡啶,91.7 μg/mL),蓋緊瓶蓋。將頂空瓶在80 ℃平衡15 min,頂空瓶中插入老化好的SPME萃取頭(250 ℃老化120 min),推出纖維頭,80 ℃吸附萃取40 min后迅速取出,將SPME纖維頭在氣質聯用儀進樣口高溫下吸附解析5 min后,通過GC-MS進行分析鑒定。

氣相條件:色譜柱:Rxi-1MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)毛細管柱;升溫程序:初始溫度35 ℃保持3 min,以10 ℃/min升至200 ℃,再以20 ℃/min升至260 ℃保持8 min;進樣口溫度250 ℃;載氣(He)流速1.5 mL/min;不分流進樣。

質譜條件:電子轟擊離子源,離子源溫度230 ℃,接口溫度280 ℃,電子能量70 eV,質量掃描范圍30～500m/z。

1.3.5 數據處理

定性分析:根據GC-MS分析得到揮發性成分的總離子色譜圖,利用計算機數據分析系統進行檢索,參照NIST14.L譜庫檢索比對,結合保留指數(retention index,RI)和相關文獻資料,進行定性分析,并描述特征風味。

參照劉青青等[12]的方法,以2,4,6-三甲基吡啶(內標),采用內標物定量法按公式(1)計算魚肉中各揮發性成分的含量:

(1)

式中:x待測,待測組分的絕對含量,μg/g;A待測,待測組分峰面積;A內標,內標物峰面積;m內標,內標物質量,μg;m,樣品質量,g。

1.3.6 主體揮發性風味成分評定方法

OAV是指各個風味物質的濃度與閾值之比,可評價各化合物對總體風味的貢獻。采用OAV法鑒別關鍵特征性風味物,參照朱文政等[13]的方法,按公式(2)計算:

(2)

式中:w,各揮發性風味物質的絕對含量,μg/g;T,各揮發性風味物質對應的閾值,μg/g。

當OAV>1時,表示該揮發性風味物質為關鍵化合物,對總體風味起主要作用;當0.1

1.3.7 數據統計分析

每組試驗獨立重復3次,結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 24.0進行顯著性分析,用Origin 2017和Excel 2016繪圖,用SIMCA-P 14.1軟件分析OPLS-DA結果,繪制得分圖和載荷圖,進行變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值分析。

2 結果與分析

2.1 不同臭氧處理時間洞庭青鯽魚肉的腥味評定

臭氧本身具有強氧化作用,臭氧浸泡處理樣品后,可起到一定的脫腥作用,臭氧脫腥后的腥味評分如圖1所示。由圖1可知,經過臭氧處理,腥味有所下降,隨著臭氧處理時間的增加,脫腥效果呈現先升高再降低的趨勢,臭氧處理5～10 min時,感官評分較高,脫腥效果較好;臭氧處理時間繼續延長,其感官評分反而有所下降,脫腥效果減弱。

圖1 不同臭氧處理時間腥味評分

2.2 脫腥前后洞庭青鯽魚肉的揮發性成分分析

對不同臭氧水浸泡時間的洞庭青鯽魚肉進行揮發性物質檢測,通過HS-SPME-GC-MS技術共檢出35種成分,揮發性物質數量和相對含量如圖2和圖3所示。

圖2 不同臭氧處理時間洞庭青鯽肉中的揮發性物質數量

圖3 不同臭氧處理時間洞庭青鯽肉中的揮發性物質相對含量

檢測出的35種揮發性化合物中包含醇類物質6種,醛類物質13種,酮類物質1種,烷烴類物質7種,酯類物質5種,其他類物質3種。其中醇類、醛類、其他類物質的數量隨著臭氧處理時間的增加,呈現先減少再增加的趨勢,在處理10～15 min時這3類揮發性物質的數量較少,三者的相對含量變化情況也與此類似。烷烴類物質的數量沒有發生變化,但其相對含量隨時間的延長先增加再減少,在10 min相對含量達到最大。檢測到的酮類和酯類物質較少,相對含量也較低。

2.3 臭氧處理對洞庭青鯽魚肉脫腥效果的影響

2.3.1 醛類物質

醛類化合物是水產品中重要的特征性風味,其主要源于不飽和脂肪酸的氧化,低分子質量的醛類物質具有較低的閾值,產生特殊氣味。由表1可知,醛類物質的總含量在各處理組中均為最高,臭氧處理后魚肉中醛類物質的總含量都降低了,其中十七碳醛和典型腥味物質(E,E)-2,4-庚二烯醛化合物被徹底脫除,對臭氧較為敏感且有腥味的正壬醛、正己醛[14]經臭氧處理后,含量均有所降低,臭氧處理10 min時,(E)-2-癸烯醛和(E)-2-壬烯醛等腥味物質[15]被徹底脫除,具有苦杏仁味的4-乙基苯甲醛含量顯著性降低。當臭氧處理時間繼續延長時,醛類物質含量反而有所上升,并且新增了正庚醛。正庚醛存在于多種水產品中,具有油脂味和腥臭味[16],產生的原因可能是臭氧加速了脂質氧化,導致了醛類物質含量的增加[17]。

表1 不同臭氧處理時間洞庭青鯽魚肉的揮發性風味物質

2.3.2 醇類物質

醇類物質主要由脂肪酸氫過氧化物降解或醛酮類等羰基化合物還原產生[16],閾值較低,對洞庭青鯽總體風味有一定修飾作用。經臭氧脫腥后,醇類物質總含量下降,2-辛炔-1-醇、1-壬醇和正己醇的含量均有所降低,臭氧處理5 min時,具淡水魚腥味物質的2-辛炔-1-醇[11]含量降至最低;臭氧處理10 min時,醇類物質總含量最低,具有青草味的正己醇、金屬味的2-乙基己醇和脂蠟味的1-壬醇被完全脫除。與醛類物質一樣,隨著臭氧處理時間的增加,醇類物質含量有所上升,脫腥效果降低。

2.3.3 其他揮發性物質

洞庭青鯽魚肉中僅檢測出一種酮類物質3-壬烯-2-酮,雖然其絕對含量較低,但有研究表明其對腥味有加強作用[18]。臭氧處理后,3-壬烯-2-酮顯著減少(P<0.05)。烷基自由基的脂質自動氧化或類胡蘿卜素分解可產生烷烴類物質[19],但其閾值較大,對總體氣味貢獻較低。酯類物質總含量較低,且閾值較大,對總體風味影響不大。1,3,5-三甲苯等其他物質含量均很低。

2.4 不同臭氧處理時間洞庭青鯽魚肉的關鍵揮發性成分分析

未經臭氧處理的洞庭青鯽魚肉中共檢測到30種揮發性化合物,但不是每一種揮發性物質都對整體風味具有貢獻,通常由揮發性物質的種類、含量以及閾值共同決定其整體風味,OAV可評估各組分對總體風味的貢獻程度,對總體風味起主要作用的稱為關鍵化合物。已有研究表明,魚肉特征腥味物質主要為醛類、烯醛類、含氮含硫類物質等,包括己醛、壬醛、辛醛、庚醛、苯甲醛、二烯庚醛、二烯癸醛、土味素、三甲胺等,主要源于藻類代謝和水體環境[20-21]。

由表2可知,共有10種物質的OAV>1,包括8種醛類物質、2種醇類物質,其中,(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛醛等5種物質OAV>100,為洞庭青鯽魚肉的關鍵化合物,這些醇醛類揮發性化合物共同決定了整體風味特征。可見,洞庭青鯽魚肉整體風味主要由油脂味、土腥味、青草味構成。其次,正己醛的OAV較大,對風味影響較大。苯甲醛和正己醇為修飾化合物(0.1

表2 臭氧處理過程中揮發性風味物質的閾值及OAV

從表2看出,經臭氧處理,構成土腥味、油脂味、青草味主體風味的(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛醛、正己醛等揮發性物質均有不同程度的降低,(E,E)-2,4-庚二烯醛被脫除。由表2可知,隨著臭氧時間的增加,具有油脂味的(E,E)-2,4-癸二烯醛OAV不斷降低,處理15 min后被全部脫除。在臭氧處理過程中,具有土腥味、青草味、油脂味等不愉快氣味的(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、1-辛醛均呈現出OAV先降低后增加的趨勢,可能是由于臭氧促進脂肪酸和醇類氧化,隨著處理時間延長,醛類物質增加,與周鴻宇等[10]探究臭氧氣浮漂洗鰱魚糜脫腥時的研究規律類似。其中,(E)-2-癸烯醛在處理10和15 min時能完全去除,(E)-2-壬烯醛在處理10 min時被脫除,正壬醛和1-辛醛在處理5 min時OAV降至最低。此外,處理20 min時產生了新的異味物質(E)-石竹烯。

2.5 基于關鍵揮發性成分的OPLS-DA

對不同臭氧處理的洞庭青鯽肉中檢測到11種關鍵揮發性化合物進行OPLS-DA。OPLS-DA得分圖(圖4)顯示,魚肉大致聚類成未經臭氧處理組、處理5～15 min組、處理20 min組三大類,說明這三大類樣品的整體揮發性物質特征發生了明顯變化。

圖4 洞庭青鯽臭氧處理過程中的OPLS-DA得分圖

其中,未經臭氧處理組在載荷圖(圖5)上與(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、1-辛醛等物質相距較近,相關性較高;處理20 min組主要與正庚醛、(E)-石竹烯、1-壬醇等物質相關性較高;而5～15 min處理組中,揮發性成分較為相近。將模型中VIP值>1的揮發性物質篩選為特征風味成分,共得到6種風味特征標志物,分別是正庚醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-石竹烯。

圖5 洞庭青鯽臭氧處理過程中的OPLS-DA載荷圖

2.6 不同臭氧處理時間洞庭青鯽特征揮發性成分聚類分析

為更直觀地區分臭氧處理過程中洞庭青鯽特征揮發性物質的變化,根據特征揮發物質含量繪制了聚類熱圖(圖6)。不同臭氧處理時間下,樣品中11種特征揮發性物質存在差異。未經臭氧處理樣品中,(E,E)-2,4-庚二烯醛、E-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、1-辛醛等含量相對較多;5～15 min處理樣品中,各特征物質種類和含量逐漸降低,部分物質如正己醛、正庚醛含量略有增加;臭氧處理 20 min時,(E)-石竹烯、正庚醛、1-壬醇含量相對較多。說明臭氧與揮發性物質發生氧化作用,造成了不同處理時間各揮發性物質的動態變化。結合感官評價,臭氧處理5～10 min可對洞庭青鯽起到較好的脫腥效果。

圖6 臭氧處理過程中洞庭青鯽特征揮發性物質聚類熱圖

3 結論

采用HS-SPME-GC-MS技術分析了臭氧處理過程中洞庭青鯽魚肉揮發性物質的變化。臭氧脫腥過程中,共檢測鑒定出35種揮發性物質,包括醇類6種、醛類13種、酮類1種、烷烴類7種、酯類5種和其他類3種。其中,(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛醛等5種物質OAV>100,為關鍵風味化合物,這些醇醛類揮發性化合物共同決定了洞庭青鯽油脂味、土腥味、青草味的整體風味特征。

經臭氧脫腥處理的洞庭青鯽魚肉,揮發性物質種類及含量均有不同程度的降低。其中,典型腥味物質(E,E)-2,4-庚二烯醛、脂蠟味的1-壬醇及氣味活性低的十七碳醛被完全脫除。醇醛類物質總含量和OAV在臭氧處理5～15 min時降至較低,其感官評分亦較高,脫腥效果較好,隨著臭氧處理時間進一步延長,脫腥效果不再增加,并且產生(E)-石竹烯等新的異味物質。腥味物質正己醛和正壬醛,苦杏仁味的苯甲醛和4-乙基苯甲醛,青草味的1-辛醛、(2Z)-2-辛烯-1-醇和2-辛炔-1-醇不飽和醇類物質,經臭氧處理后雖不能完全脫除,但含量下降,但繼續延長臭氧處理時間,反而會促進脂肪氧化產生醛類物質。經OPLS-DA篩選到6種風味特征標志物(VIP >1),分別是正庚醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-石竹烯。OPLS-DA結合聚類分析表明,臭氧處理能有效減輕洞庭青鯽魚肉腥味,臭氧脫腥處理5～10 min時洞庭青鯽肉的主體風味特征接近,且可根據特征標志物含量對不同脫腥程度的樣品進行有效區分。