郫縣豆瓣醬香氣萃取方法優化與其成分表征

唐源,于明光,王寶松,王瑩,宋煥祿

(北京工商大學 食品與健康學院,北京,100048)

郫縣豆瓣醬源于四川,是中國著名的地理標志性產品,作為一種調味品,其色澤紅亮,香氣獨特,被譽為“川菜之魂”[1]。豆瓣醬通常由辣椒和蠶豆兩大原料經微生物發酵和曬缸工藝制成[2]。風味是反應豆瓣醬整體質量的重要指標,明確豆瓣醬中的關鍵香氣化合物對其后續工業化生產的質量把控有重要意義[3]。目前,國內外對豆瓣醬香氣研究所用的萃取方法可以歸結為3類,以固相微萃取(solid phase micro-extraction, SPME)和攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)為代表的非溶劑萃取的萃取方式,以溶劑輔助風味蒸發(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)為代表的有溶劑輔助的萃取方式,以同時蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)為代表的蒸餾萃取方式[4-5]。喬鑫等[6]采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(solid phase micro-extraction- gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)對工業化生產豆瓣醬和傳統釀造豆瓣醬的揮發性成分進行分析,分別鑒定出39和38種揮發性化合物;ZHAO等[7]采用SBSE與GC-MS聯用,并結合氣相色譜-嗅聞(gas chromatography-olfactometry,GC-O)技術,結果顯示,乙酸和苯乙醛等化合物對豆瓣醬香氣有重要貢獻;ZHANG等[8]采用SDE-GC-O-MS與香氣化合物稀釋分析(aroma extraction dilution analysis, AEDA)結合,鑒定出22種香氣化合物,其中4-乙基愈創木酚、苯甲醛和2,5-二甲基吡嗪等化合物的風味稀釋(flavor dilution, FD)因子較高,是豆醬中的關鍵香氣物質;LI等[9]使用SAFE與SPME兩種萃取方法與GC-O-MS聯用,結合AEDA在豆瓣醬中共鑒定出苯乙醇、3-甲基丁酸等13種FD≥2的香氣活性化合物。這些研究表明采用不同的萃取方法會導致鑒定出的關鍵香氣化合物的種類和數量存在差異,從而影響豆瓣醬的特征香氣表征的全面性和準確性。同時,關于豆瓣醬的特征香氣能否被上述方法最大程度萃取也鮮有報道,只有選擇合適的方法才能萃取出種類更為全面的香氣化合物,最大限度地反映樣品的真實香氣特征[10]。

本研究首先對比不同萃取方法對豆瓣醬香氣的提取效果,篩選出更適合豆瓣醬樣品香氣物質的萃取方法;然后基于篩選出的萃取方法,結合AEDA解析各香氣化合物的貢獻程度,明確豆瓣醬中關鍵的香氣活性化合物;最后對關鍵香氣活性化合物進行定量分析并計算氣味活性值(odor activity value, OAV),進一步表征豆瓣醬的香氣特征。研究將為豆瓣醬風味特征的全面解析提供理論支持與指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品Y1和Y2,鵑城牌郫縣豆瓣醬公司,樣品信息如下:

Y1:二荊條辣椒、曬瓣子等,曬缸制作,發酵3年;Y2:二荊條辣椒、美國紅辣椒、烘瓣子等,曬場條池制作,發酵1個月。在分析之前所有樣品均儲存在實驗室冰箱內(4 ℃)。

無水乙醚、無水Na2SO4、NaCl(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;正己烷、正構烷烴(C8～C25)、2-甲基-3-庚酮、己醛、庚醛、1-辛烯-3-酮、2,5-二甲基吡嗪、二甲基三硫醚、壬醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、3-甲基丁酸、α-萜品醇和4-乙基愈創木酚(色譜純),美國Sigma公司;氦氣(99.999 0%)、氮氣(99.999 2%)和液氮(99.999 0%),北京氦普北分氣體工業有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-MS包括7890A型氣相色譜和7000型質譜,美國Agilent公司;極性DB-WAX毛細管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),美國J&W Scientific公司;ODP4型嗅聞儀,德國Gerstel公司;GC×GC-MS包括8890A型氣相色譜和5977型質譜,美國Agilent公司;SSM1800固態調制器,中國上海J&X Technologies公司,使用2根色譜柱,DB-Wax色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國J&W Scientific公司和DB-17毛細管柱(1.85 m×0.18 mm,0.18 μm),美國J&W Scientific公司;Sniffer 9100型嗅聞儀,瑞士Brechbuhler公司;多功能自動進樣器(multi-purpose autosampler, MPS)、熱脫附系統(thermo-desorption unit, TDU)、PTV冷卻型進樣口(cool injection system , CIS)和玻璃襯管,德國Gerstel公司;溶劑輔助風味蒸發裝置,德國Glasblaserei Bahr公司;Vigreux柱(10 cm×1 cm),北京半夏科技發展有限公司;HN200氮吹儀,濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 香氣萃取方法

1.3.1 SPME

取2 g豆瓣醬、8 g超純水和1 g NaCl于20 mL頂空瓶中,加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL),55 ℃平衡20 min,然后插入75 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭,吸附40 min。吸附結束后在GC進樣口230 ℃下解析5 min。每種樣品重復3次。

1.3.2 SBSE

參考并根據實際情況優化ZHAO等[7]的SBSE萃取法。取2 g豆瓣醬、8 g超純水和1 g NaCl于40 mL頂空瓶,加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)。隨后加入攪拌棒萃取器(PDMS涂層,長10 mm,厚度0.5 mm),在55 ℃下設定轉速120 r/min,萃取90 min,萃取結束后用超純水清洗晾干,轉移到玻璃熱脫附管中進行解析。每種樣品重復3次。

1.3.3 SAFE

取25 g豆瓣醬,加入10 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL),使用100 mL乙醚進行萃取,180 r/min攪拌2 h(4 ℃),重復2次,合并有機相,在40 ℃的真空環境下進行SAFE蒸餾,將所得餾出物用Na2SO4(無水)干燥,使用Vigreux柱濃縮至10 mL,然后氮吹至500 μL,進樣1 μL。每種樣品重復3次。

1.4 氣相色譜-質譜參數

1.4.1 GC分析條件

色譜柱:DB-WAX(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);不分流模式進樣;載氣為99.999%氦氣,流量1 mL/min,壓力15.71 kPa;升溫程序:初始溫度50 ℃,然后以3 ℃/min的速率升溫至230 ℃。

1.4.2 GC×GC分析條件

SPME和SBSE進樣,不分流模式;液體進樣,采用分流模式,分流比9∶1;載氣為99.999%氦氣,流量1 mL/min,壓力15.71 kPa;進樣口溫度230 ℃,兩根色譜柱分別為DB-Wax色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)和DB-17毛細管柱(1.85 m×0.18 mm, 0.18 μm);柱溫箱升溫程序:初始溫度50 ℃,然后以3 ℃/min的速率升溫至230 ℃;固態調制器測定的冷區溫度-50 ℃,加熱區的入口和出口溫度分別為70、160 ℃;調制周期4 s。

TDU升溫程序:初始溫度50 ℃,維持1 min,后以100 ℃/min升至280 ℃,維持5 min。

CIS升溫程序:超低溫液氮先將CIS溫度迅速降到-80 ℃,待TDU解吸完成之后,再以10 ℃/min升到250 ℃,維持1 min。

1.4.3 MS條件

電子轟擊(electronic ignition,EI)離子源,電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四桿溫度150 ℃,掃描模式為全掃模式,溶劑延遲4 min,質量范圍m/z40～350。

1.4.4 嗅聞儀條件

傳輸線溫度280 ℃,嗅聞口溫度200 ℃,通入濕潤的N2氣保持實驗員鼻腔濕潤。實驗員準確記錄嗅聞到的氣味特征和出現時間。

1.5 定性分析

通過質譜圖(MS)、保留指數(retention index,RI)、嗅聞結果(olfactometry,O)和標準化合物(standard compound,STD)對比鑒定郫縣豆瓣醬中的香氣化合物。化合物的保留指數則通過正構系列烷烴(C8～C25)的保留時間計算得到,RI值計算如公式(1)所示:

(1)

式中:n,系列烷烴中碳原子個數;Tn,正構烷烴Cn的保留時間,min;Ta,樣品中化合物a的保留時間(化合物a的保留時間在Cn與Cn+1之間),min。

1.6 AEDA

通過調節分流比(0、1∶3、1∶9、1∶27、1∶81等)進行AEDA分析,直到實驗員在嗅聞口聞不到任何氣味時停止稀釋,得到相應的FD定義為1、3、9、27、81等。香氣化合物的FD因子越高,該化合物對食品整體香氣貢獻就越大。

1.7 香氣活性化合物定量分析

根據AEDA的結果,使用GC-MS對豆瓣醬香氣活性化合物(FD≥9)進行精確定量[11],將標準品梯度稀釋,根據加入標準品溶液的濃度與其經儀器分析得到的峰面積之間的關系,繪制標準曲線,然后在相同實驗條件下對豆瓣醬樣品進行檢測,將測得的香氣化合物的峰面積帶入對應標準品的標準曲線,即可得到豆瓣醬樣品中對應物質質量分數,以μg/kg為單位計算。所有分析重復3次。

1.8 OAV的計算

OAV定義為香氣化合物濃度與閾值之比,可驗證香氣化合物對樣品特征香氣的貢獻程度。按公式(2)計算:

(2)

式中:ρa,化合物a的質量濃度,μg/kg;ρ(OTa),化合物a在水中的閾值,μg/kg。

1.9 數據處理

樣品中香氣化合物的含量均以平均值±標準差表示。采用Microsoft Excel 2016對數據進行統計分析,柱狀圖由Origin 2018軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 三種萃取方法的效果對比

為避免使用單個樣品的實驗偶然性和片面性,本研究選用2種發酵時長差異較大的豆瓣醬樣品。3種前處理方法結合GC×GC-O-MS在Y1和Y2中共鑒定出香氣化合物45種,如表1所示。其中,醇類11種、酸類9種、醛類7種、酯類6種、酮類4種、酚類3種、吡嗪類2種、吡咯類1種和含硫化合物2種。Y1中共檢測到香氣化合物45種,SPME、SBSE和SAFE分別提取到香氣化合物33、39和24種。其中,3-甲基丁醛、2/3-二甲基丁酸乙酯和二甲基三硫醚等9種香氣化合物僅通過SBSE富集后被感官人員所嗅聞到,明顯高于SPME(3種)和SAFE(1種)萃取方式中特有的香氣化合物。Y2中共檢測到香氣化合物36種,SPME、SBSE和SAFE分別提取到香氣化合物25、33和26種。與Y1相同,采用SBSE富集到的可被嗅聞到的香氣化合物的種類最為豐富,同時特有化合物的種類也最多。這說明,不同萃取方法對于豆瓣醬中的香氣化合物的萃取效果有較大差異[12]。因此,針對不同的樣品選擇適合的香氣萃取方法是必要的。從萃取的香氣化合物數量上來看,對于豆瓣醬樣品,萃取效果依次為:SBSE、SPME、SAFE,這可能是因為SAFE制樣操作復雜、耗時長造成了香氣化合物的損失[13],SBSE的吸附劑涂層量比SPME大,因此SBSE具有更大的樣品容量和更好的重現性[14]。因此,相比于SPME和SAFE,SBSE是更適合豆瓣樣品香氣化合物富集的有效方法。

表1 不同萃取方法下豆瓣醬的香氣化合物萃取結果

2.2 豆瓣醬香氣化合物分析

不同萃取方法下2個豆瓣醬樣品中各類香氣化合物的數量如圖1-a、圖1-b所示。2個豆瓣醬樣品中,采用3種提取方法得到的醇類、醛類、酸類和酯類化合物數量較多,酮類、酚類、吡嗪類、吡咯類和含硫化合物數量較少。Y1中檢測到的各類化合物數量普遍多于Y2,這可能是因為Y1的發酵時間較長,而豆瓣醬的香氣主要在后熟發酵過程中產生[15]。原料中的蛋白質、淀粉和脂肪等大分子物質分解生成各類小分子風味前體物,繼而在多種微生物的共同作用下生成酚類、醛類、酮類、醇類等小分子風味物質,從而形成了豆瓣醬的典型風味特征。

a-Y1中香氣化合物數量;b-Y2中香氣化合物數量

醇類化合物是酯化反應的重要前體物,主要由不飽和脂肪酸氧化降解產生,對郫縣豆瓣整體風味有重要貢獻,在食品中常呈甜香氣味[16]。在Y1和Y2中檢測到的醇類化合物數量最多。2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇和3-甲基丁醇等化合物在Y1和Y2中均被檢出。據報道,這些醇類香氣化合物不僅存在于中國豆瓣醬[17]中,也存在于日本味噌[18]和韓國大醬[19]中,是豆類發酵食品中常見的香氣化合物。

醛類化合物主要呈現青草、柑橘等氣味,通常由脂肪氧化和Strecker降解產生[20]。醛類化合物閾值較低,對豆瓣醬的整體香氣有較大貢獻。其中,3-甲基丁醛、壬醛和糠醛等醛類化合物在2種豆瓣醬樣品中均被檢出,這與前人報道豆瓣醬的香氣化合物結果相似[21]。

豆瓣醬中的酸類物質有微生物降解、原料酶解、脂肪水解等多種來源[7]。在2種豆瓣醬樣品中共檢測出了乙酸、3-甲基丁酸等9種酸類香氣化合物,這些酸類物質在豆制品發酵產品中較為常見[18],在食品中產生汗酸味、腐臭味等不愉快氣味。

2.3 香氣活性化合物分析

Y1中檢測到的香氣化合物總數高于Y2(表1),且2個樣品中SBSE法檢測到的香氣化合物數量高于SPME和SAFE。為較為全面地分析郫縣豆瓣醬中香氣活性化合物,故選用SBSE法對香氣特征更為豐富的Y1進行AEDA,通過逐漸縮短提取時間達到稀釋效果。結果如表2所示,39種香氣活性化合物在Y1中被檢出,其中11種化合物被認為是重要的香氣活性化合物(FD≥9)。

表2 SBSE法對Y1樣品香氣活性化合物的AEDA結果

Y1中各類化合物FD因子如圖2所示。Y1中醇類和酸類香氣活性化合物個數較多,然而香氣貢獻率不高,兩者不呈正相關,可能是因為醇類、酸類化合物閾值普遍比較大,故對豆瓣醬的整體香氣的貢獻度較低[22]。但1-辛烯-3-醇較為特殊(FD=81),表現出類似蘑菇香氣,這可能是由于其為不飽和醇,其閾值低于飽和醇,易被人感知[23],1-辛烯-3-醇在封閉式和開放式發酵的豆瓣醬中均被鑒定為關鍵香氣活性化合物[24],對豆瓣醬特征香氣有較大貢獻。含硫化合物為二甲基三硫醚(FD=243),能賦予豆瓣醬肉香、洋蔥等香氣,推測來源于豆瓣醬中添加的蒜等香辛料[25]。4-乙基愈創木酚(FD=81)呈煙熏味,在豆瓣醬中通常相對含量較高[26],是豆瓣醬后熟發酵的重要關鍵香氣成分。

圖2 Y1中各類化合物的FD

2.4 豆瓣醬中關鍵化合物的定量分析與OAV分析

采用外標法對AEDA得到的11個關鍵香氣活性化合物進行定量分析,結果如表3所示,所有香氣物質標準曲線相關性系數R2均介于0.992 2～0.998 1,線性良好,Y1中3-甲基丁酸和2,5-二甲基吡嗪含量較高。3-甲基丁酸通常被認為由亮氨酸分解產生,是發酵制品中常見的揮發性化合物[27]。吡嗪類化合物主要來源于原料中蛋白質和氨基酸的熱分解和美拉德反應,2,5-二甲基吡嗪是美拉德反應的重要產物,能賦予食品濃郁的堅果香氣[28]。然而,Y1中3-甲基丁酸和2,5-二甲基吡嗪的FD因子和OAV較低,其原因是這2種化合物的氣味閾值較高,難以被人們感知,因此,單獨分析香氣化合物含量的多少并不能說明該物質對食品整體香氣的貢獻。

表3 豆瓣醬關鍵香氣活性化合物定量結果和OAV

OAV是評價香氣化合物香氣強弱以及樣品香氣貢獻度大小的重要指標之一,OAV≥1,表明該化合物對豆瓣醬整體風味具有貢獻,數值越大表示貢獻越大[29]。Y1中己醛(FD=729,OAV=68)和1-辛烯-3-酮(FD=729,OAV=67)對豆瓣醬的整體香氣貢獻較大,分別為豆瓣醬提供了青草味和蘑菇味。己醛是豆制品中常見的化合物,是豆漿、豆腐等豆制品中豆腥味的主要來源[30],也是評估油脂氧化程度的重要指標,在肉制品、乳制品等食品原料中均有應用[31]。己醛和1-辛烯-3-酮主要來自于花生四烯酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化[32],豆瓣醬中的脂肪主要來源于蠶豆、辣椒等植物性原料,含量約為12.25%,脂質經微生物代謝分解成脂肪酸等小分子物質,為豆瓣醬中己醛和1-辛烯-3-酮等香氣活性化合物形成提供了原料[33]。

3 結論

本研究使用GC×GC-O-MS結合SPME、SBSE和SAFE三種萃取方法對豆瓣醬的香氣進行全面的解析,并比較了不同萃取方法富集豆瓣醬樣品的香氣化合物的適宜程度。結果表明,使用SBSE法對豆瓣醬香氣化合物的萃取更全面,采用SBSE-GC×GC-O-MS,在Y1中共檢測出39種香氣活性化合物,經過計算FD因子和OAV,篩選出其中11種關鍵香氣化合物,分別為己醛、庚醛、1-辛烯-3-酮、2,5-二甲基吡嗪、二甲基三硫醚、壬醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、3-甲基丁酸、α-萜品醇和4-乙基愈創木酚,對豆瓣醬的青草味、煙熏味和蘑菇味等香氣有較大貢獻。本研究篩選出了一種適合豆瓣醬的香氣化合物萃取方法,明確了豆瓣醬中的關鍵香氣化合物,可以作為改進豆瓣醬生產工藝的理論依據。