肉制品中鋅原卟啉形成研究進展

趙改名,王興輝,祝超智*,崔文明,王小鵬,溫耀涵,張文華,李航

1(河南農業大學 食品科學技術學院,河南 鄭州,450002)2(國家肉牛牦牛產業技術體系中衛站,寧夏 中衛,750000)3(河南恒都食品有限公司,河南 泌陽,463700)

在“健康中國2030”的背景下,食品與消費者健康之間的關系日益密切,肉中因富含優質蛋白質、脂肪、維生素等營養成分,作為一種兼備營養和美味的食物一直以來都受到人們的青睞,肉制品加工產業也逐漸成為促進我國經濟發展的支柱產業和提高國民健康水平的動力[1]。肉制品的表觀色澤是影響消費者購買行為的主要因素,而亞硝酸鹽是肉制品加工時常用的一種護色劑,在肉制品色澤保護中起到了重要的作用。然而亞硝酸鹽也會與肉制品中蛋白質降解產生的胺類物質反應形成亞硝胺;此外如果過多的亞硝酸鹽被人體攝入,也會與人體內的胺類物質發生反應形成亞硝胺,其嚴重的毒副作用會對人體健康造成威脅[2]。目前存在的無硝發色技術仍有色澤不穩定、不良風味、高溫易分解等問題,已成為肉制品行業亟待解決的難題[3]。因此研發新型無硝發色技術迫在眉睫。

鋅原卟啉(zinc protoporphyrinIX,ZnPP)是一種以Zn2+配位于原卟啉IX(protoporphyrinIX, PPIX)的形式獨特存在于肉制品中穩定且鮮艷的紅色素,最早發現于一種來自意大利北部帕爾瑪地區長時間發酵成熟的帕爾瑪火腿中,其肉質在不添加亞硝酸鹽/硝酸鹽的情況下,即使暴露在光或熱下仍能呈現穩定的鮮紅色[4]。隨后在我國著名的金華火腿加工過程中也發現了這一現象,但因檢測技術的限制,并未確定造成該現象的具體物質[5]。直到2004年通過多種光譜技術分析檢測才確定了這種獨特的紅色素主要為鋅原卟啉IX(ZnPP)[6]。研究表明,帕爾瑪火腿中色素ZnPP的形成有3種可能的機制:厭氧條件下金屬離子的非酶取代反應[7];亞鐵螯合酶(ferrochelatase, FECH)直接參與的酶促反應[8];細菌的酶促反應[9]。

目前對于ZnPP的研究主要集中在傳統干腌火腿制品、發酵干香腸制品及發酵肉糜中,如探究傳統干腌火腿加工工藝對ZnPP形成的影響、篩選具有高ZnPP形成能力發酵菌株來提高肉制品色澤、在發酵肉制品中探究發酵條件對ZnPP形成的影響等,然而對ZnPP在肉制品中形成機制的研究尚不完善。因此,本文綜述了ZnPP的化學結構及在肉制品中的形成過程、ZnPP形成速率的影響因素及ZnPP形成機理研究,以期為肉制品的無硝護色提供新的思路及理論支持。

1 肉制品中色素種類及其衍生物ZnPP形成過程

1.1 肉制品中色素種類

肉制品中主要的紅色素為血紅素,在肌肉中主要以肌紅蛋白的形式存在,特定條件下肌紅蛋白可轉化為多種衍生物,直接影響肉色特征與穩定性[10]。

肌紅蛋白是肌肉中的主要顯色物質,它由血紅素和珠蛋白構成;血紅素是一種卟啉類化合物(圖1為血紅素結構示意圖),它由4個吡咯環連接成一個大環,稱為卟啉環[11]。卟啉環中心的Fe2+有6個配位部分,且其中4個分別與4個吡咯環上的氮原子以配位鍵的形式結合,另一個與球蛋白上的93位氨基酸殘基上的氮原子相連,而第6個配位鍵缺乏配體,可與O2、CO等小分子配位結合這也造成了肉制品色澤的不穩定[12]。

圖1 血紅素結構

肉制品色澤的不穩定主要是由于肌紅蛋白化學性質、鐵的價態變化以及卟啉環中Fe2+的第6位配體不同造成的,表1為肉制品中常見的色素名稱及對應色澤。當卟啉中心以Fe2+形式存在時,色素為正常的肌紅蛋白,此時肉制品的表觀色澤表現為紫紅色。但這種還原態的肌紅蛋白化學性質不穩定,向著2種不同形式轉化[13]。當周圍環境中O2含量過高時色素分子以氧合態肌紅蛋白分子為主,此時肉制品的表觀色澤表現為鮮紅色,這便是人們喜歡的肉制品的顏色;另外一部分的肌紅蛋白則被O2氧化成高鐵肌紅蛋白,此時肉制品的表觀色澤為棕褐色[14-15]。而在帕爾瑪火腿色素分子的研究中,發現導致其具有穩定鮮紅色澤的特有成分為鋅原卟啉。圖2為鋅原卟啉結構示意圖,與肉制品中常見色素以不同類型肌紅蛋白分子(即珠蛋白與血紅素復合體)存在所不同的是,帕爾瑪火腿中色素分子ZnPP是一種游離的血紅素衍生物,是由同為二價的Zn2+取代卟啉環中心的Fe2+所形成[7]。此外在體內,其他二價金屬離子包括鈷和錫,也可形成其他金屬卟啉。

表1 肉制品中的主要色素

圖2 鋅原卟啉的結構

1.2 血紅素衍生物ZnPP形成過程

血紅素是由FECH化金屬形成的,在其生物合成的最后一步,位于動物線粒體的內膜上的FECH催化Fe2+插入進入原卟啉形成血紅素[16]。而在肉制品特別是干腌火腿中ZnPP的形成被認為源于肌紅蛋白的轉化過程,Fe2+從血紅素分子中脫去,在適宜的外部條件下Zn2+隨即插入卟啉環的中心,即鐵被鋅取代,同時血紅素部分從天然血紅素蛋白中分離,形成ZnPP[17]。另一方面Zn2+是Cu2+之后第二容易插入卟啉的金屬離子,Zn2+無需催化劑也能容易地插入卟啉[18]。最近的研究表明在肉的腌制和火腿成熟過程中,肌紅蛋白被內源性肽酶部分降解,隨后肌紅蛋白和FECH相互作用,從而促進ZnPP的形成[19]。

2 ZnPP形成機制

2.1 金屬離子的非酶取代反應

肉制品中ZnPP的形成被認為是一種非酶反應,在厭氧條件下,Zn2+取代Fe2+,同時使血紅素部分從血紅蛋白中分離[7]。將成熟的火腿放在4 ℃的條件下儲存一段時間,在火腿樣品中仍然能檢測出一定量的ZnPP,但研究表明大鼠中FECH活性在50 ℃最佳,小鼠中FECH活性在40 ℃最佳,而豬肉中FECH活性在25 ℃最佳;4 ℃的低溫儲存環境,加上火腿中較高的食鹽濃度,這樣嚴苛的外部條件顯然不適于FECH發揮其活性,因此部分學者認為這種條件下ZnPP的形成為非酶的取代作用。PAROLARI等[20]將低溫(3～4 ℃)條件下發酵成熟的火腿與正常加工條件下(16 ℃)成熟的火腿比較發現,低溫條件下成熟的火腿仍呈現鮮艷的紅色,且在發酵后期(9～12月)ZnPP增加量較正常發酵組顯著提升。雖然許多體外模擬實驗在一定程度上表明酶在ZnPP形成過程中發揮了作用,但在這些研究中也提出非酶促反應下ZnPP也可以形成,并且非酶促過程隨著酶活性的降低在成熟的后期變得重要,但此反應過程需要較長的反應時間[8-9]。

2.2 內源酶的取代反應

FECH是亞鐵血紅素生物合成途徑的最后一步酶,且在多種生物中這種酶幾乎都會存在[21]。研究發現,FECH在ZnPP 形成的過程中起到至關重要的作用,首先還原酶把血紅素中的Fe3+還原為Fe2+,然后 FECH除去Fe2+,使Zn2+插入到卟啉中形成 ZnPP[22]。此外FeCH不僅參與Fe2+的插入,而且參與各種二價金屬離子的插入,例如Zn2+、Co2+、Mn2+等進入卟啉環,鋅是銅之外第2個容易插入卟啉環的金屬離子;在三級結構水平上人類和動物、細菌的FECH保持高度相似,僅在氨基酸序列上略有不同[23]。這些發現為ZnPP的酶促合成技術研究提供可靠的理論依據。此外組織蛋白酶B和L是意大利、西班牙和中式干腌火腿成熟過程中最常涉及的2種肽鏈內切酶,在火腿成熟過程中起到重要水解蛋白質的作用,蛋白質的適度水解會促進亞鐵血紅素的釋放,更利于ZnPP的形成。GROSSI等[19]研究了組織蛋白酶在帕爾瑪火腿成熟過程中對于肌紅蛋白降解的作用,結果表明組織蛋白酶促進肌紅蛋白的降解對亞鐵血紅素的轉金屬反應有顯著作用。

2.3 細菌的酶反應

因為豬腿中初始微生物有限,早期的研究普遍認為微生物并沒有參與干腌火腿中ZnPP的形成[7]。后來隨著不斷的研究,人們發現干腌火腿的顏色或顏色的變化可能取決于微生物的生長[5]。GHADIRI等[24]通過對比接種P.fluorescens后肉勻漿中ZnPP的含量變化,發現P.fluorescens具有形成ZnPP的能力。細菌誘導的ZnPP形成似乎強烈依賴于食物基質中作為微生物營養物質的多肽和蛋白質的可用性。在肉勻漿中肉本身的固有蛋白質和肽可以立即被微生物利用,從而導致ZnPP的形成顯著增加。PAGANELLI等[25]以大腸桿菌BL21為載體,表達枯草芽孢桿菌中FECH形成的相關基因。然后以分離和純化后的枯草芽孢桿菌FECH(BsFECH)為外源性酶與四苯基卟啉磺酸鹽(TPPS)的水溶液、醋酸鋅(Zn2+)和部分亞鐵肌紅蛋白的水解溶液作為模型底物,模擬了干腌火腿成熟過程中紅色素ZnPP形成的過程。此外研究發現諸多乳酸菌在合適的條件下都可以在發酵過程中產生ZnPP[26]。這種細菌的酶反應與內源酶的酶促反應類似,都可以增加ZnPP。

通過闡述該研究領域目前存在的3種假說可以發現,現階段對于每種假說都有一定的研究結果支持。本文認為上述的幾種ZnPP形成機制是共同存在的,只是在不同類型的肉制品中及不同的成熟階段,對ZnPP形成起到的影響程度不同。

3 ZnPP形成過程中的影響因素

3.1 FECH的數量及活性

FECH位于哺乳動物細胞線粒體內膜,催化Fe2+插入到原卟啉IX中形成原血紅素[27]。實驗發現在肉勻漿中添加Zn2+和PPIX會形成大量ZnPP,而在緩沖液中這一現象并不明顯,這表明FECH在ZnPP形成過程中的作用以及肉制品中存在內源FECH影響ZnPP的形成。ISHIKAWA等[28]對ZnPP的合成做了進一步研究,用豬心臟以及豬心臟線粒體與肌紅蛋白、ZnCl2合成ZnPP,合成量顯著增大。可能因為豬心臟中富含線粒體細胞器,此前研究表明FECH位于哺乳動物細胞線粒體內膜,更多的FECH加速了ZnPP的形成,此外有學者研究發現與肌肉線粒體的豬FECH相比,位于心臟線粒體中的FECH的數量和活性更高[22]。在體外條件下Zn2+也可以被目前鑒定的FECH插入到原卟啉IX中;CHAU等[29]將豬FECH的DNA克隆在大腸桿菌中表達形成重組FECH,并進一步鈍化用于研究模擬內源FECH在ZnPP形成過程中的作用,PAGANELLI等[25]也將枯草芽孢桿菌FECH做類似表達,重組FECH可短時高效提升ZnPP的形成能力。未來可在研究中分離、重組環境及生物中產生的FECH,選取優勢重組酶應用于實際。

3.2 食鹽添加量

在帕爾瑪火腿的生產中主要的輔料為海鹽,在長時間的成熟過程中,鹽促進成熟并防止肉的腐敗,研究發現海鹽的添加量會影響ZnPP的形成,BENEDINI等[7]通過在研究值范圍內對豬肉勻漿添加不同含量NaCl發現,鹽的添加導致了FECH的活性顯著提升,當食鹽質量濃度為80 g/L時,ZnPP形成效果最好。BECKER等[30]通過控制肉糜中不同NaCl添加量檢測ZnPP含量發現,在3%(質量分數)NaCl的添加量下短時間內ZnPP的形成量最多;當NaCl添加量提升至7%時發現腌制初期ZnPP含量明顯低于較低NaCl添加組,表明高濃度的鹽對ZnPP的形成有抑制作用,但隨著腌制過程的進行,ZnPP含量呈明顯上升趨勢。這與傳統干腌火腿中表現的結果一致,傳統干腌火腿NaCl添加量大都在6%～9%,經過長時間的成熟,也能產生大量的ZnPP,使肉制品表現為穩定的鮮紅色[31]。

此外有學者認為食鹽能夠促進ZnPP生成是通過影響肌紅蛋白水解指數來實現的,研究發現適宜的食鹽添加對ZnPP的形成有一定的促進作用,且在此范圍內蛋白質水解指數與食鹽含量呈正相關[32]。PAGANELLI等[25]通過體外模擬研究也驗證了肌紅蛋白水解程度促進ZnPP生成這一猜想,在肌紅蛋白溶液中加入適量的胃蛋白酶促進蛋白水解,結果發現合適的水解程度下ZnPP生成量顯著提升。

3.3 螯合劑

帕爾瑪火腿成熟過程中鐵和鋅參與金屬化反應,且這些金屬離子可與蛋白質、各種較小的有機分子和存在于肉制品汁液中的無機陰離子強烈結合,此類螯合物的存在可能促進或抑制金屬轉移[33]。BECKER等[30]比較了添加不同濃度磷酸鹽溶液的肉勻漿,結果表明與不含磷酸鹽的肉勻漿相比,添加磷酸鹽的肉勻漿中ZnPP增加。這是由于在此實驗條件下,磷酸鹽與血紅素中Fe2+結合形成配合物,此時“血紅素”以原卟啉的形式存在。由于肉中本來就存在大量的與Fe2+化學結構性質相似的Zn2+,原本Fe2+位置就被Zn2+所取代,Zn2+與原卟啉螯合形成ZnPP,起到改善肉制品色澤的作用。而EDTA作為Zn2+的強力螯合劑,會與其發生絡合反應,限制Zn2+的轉移,從而阻礙ZnPP的形成[34]。

3.4 微生物

因為豬腿中初始微生物有限,早期研究認為微生物并沒有參與干腌火腿中ZnPP的形成[7]。WAKAMATSU等[18]研究發現,與添加抗生素組相比,在不添加時豬肉勻漿中ZnPP含量會增加,這表明微生物的存在促進了ZnPP的形成。研究表明在肉糜中添加分歧型卡諾桿菌(Carnobacteriumdivergens)和液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens),可顯著增加ZnPP的形成,但這2種菌株會導致生肉和海鮮變質或成為某些疾病的病原體,因此亟待開發可用于肉制品生產的安全的發酵菌株[35-36]。ASADUZZAMAN等[37]近期對不同動物產品中使用的11種細菌以及從環境和益生菌源分離的126種細菌ZnPP的形成能力進行評估,其中3種乳酸菌,乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和糞腸球菌(Enterococcusfaecium)顯示出較高的ZnPP形成能力。傳統的這類發酵一般控制在無氧條件下進行,KAUSER-UL-ALAM等[38]在有氧的條件下進行發酵,評價5種乳酸菌的ZnPP形成能力;結果發現,其中的4株乳酸菌在有氧條件下ZnPP形成量較無氧條件大大降低;而乳酸乳球菌亞種在這一條件下仍表現出較強的ZnPP形成能力,更適用于實際加工中改善發酵肉制品的顏色。

3.5 pH

對于ZnPP的研究主要集中在干腌火腿及發酵肉制品中。與干腌火腿不同的是,發酵肉制品的pH根據發酵劑的種類不同以及發酵時間的變化而變化,因此pH為影響發酵肉制品ZnPP形成的一個重要因素。DE MAERE等[39]的研究表明,在不同pH條件下無亞硝酸鹽干發酵香腸生產過程中,天然色素ZnPP及其相關原卟啉和亞鐵血紅素的含量不同,ZnPP只有在pH高于4.9的干燥發酵香腸中才能形成,同樣,在增加pH和生產時間的條件下,觀察到亞鐵血紅素的分解,PPIX也在肉制品中不斷積累。CHAU等[23]實驗結果表明pH在5.5～6.0更利于血紅素的分解,Fe2+從卟啉環中脫下;而在7.5～8.0條件下更利于Zn2+插入原卟啉,形成穩定的ZnPP。WAKAMATSU等[40]通過對不同pH、肌纖維類型的豬骨骼肌的研究發現,ZnPP和PPIX在不同的pH條件下形成機制也不同,在pH 4.75、5.5時有較多量的ZnPP形成,在pH 4.75時觀察肌紅蛋白的降解,ZnPP和PPIX含量均升高,血紅素含量無明顯降低;pH 4.75時ZnPP和PPIX的形成比pH 5.5時更明顯。

3.6 酶抑制劑

在醫學領域人們也對ZnPP及FECH進行了廣泛研究,FECH在表達缺失或者活性受到抑制時,可導致亞鐵血紅素生物合成受阻以及體內原卟啉蓄積過量的游離原卟啉,與Zn2+形成ZnPP,是血紅素生物合成的副產物[27]。此外Pb2+作為一種重金屬離子可抑制FECH活性,影響Fe2+與原卟啉的螯合,導致原卟啉蓄積過量,進而與Zn2+的結合增加,ZnPP合成增加,醫學上常提到的鉛中毒就是這個原理[41]。也有研究指出Pb2+影響亞鐵在PP中的插入,而不影響鋅的插入,導致PP和ZnPP的積累[42]。BECKER等[30]通過在豬肉勻漿中添加不同濃度Pb2+一段時間后發現,低濃度對ZnPP形成無顯著影響,高濃度添加促進了ZnPP形成。筆者認為這可以理解為不同條件Zn2+與Fe2+競爭性作用不同。首先Fe2+、Zn2+可以在適宜的條件下插入原卟啉形成對應金屬卟啉化合物,也可以在FECH螯合下更高效地插入;但當FECH、Zn2+、Fe2+三者同時存在時,酶促反應優先進行,而FECH又優先插入Fe2+,當特殊條件下FECH活性被抑制,這時機體中的Zn2+優先與原卟啉結合,因此在肌肉中形成ZnPP。

3.7 硝酸鹽及亞硝酸鹽

硝酸鹽因其具有良好的發色、抗氧化、抑菌等作用而被廣泛應用于肉制品加工中,但在帕爾瑪火腿加工中并未添加此類物質[43]。ADAMSEN等[31]通過對多種類型干腌肉制品的調研發現,那些含有亞硝基肌紅蛋白的產品中幾乎不能檢測到ZnPP存在。WAKAMATSU等[18]2007年發現,與未添加亞硝酸鹽的對照組相比,添加NaNO2的ZnPP含量降低了約80%。研究表明亞硝酸鹽產生的NO對ZnPP形成產生抑制作用,且ZnPP的前體物質原卟啉的含量也隨著NO的加入而減少[44]。對于這一現象可能存在以下2種原因:NO與肌紅蛋白反應形成亞硝基肌紅蛋白,這可能阻止亞鐵血紅素從肌紅蛋白分子上解離釋放,更抑制了Fe2+從血紅素釋放出去[37];NO可以抑制豬肉中的FECH,阻止Zn2+插入原卟啉。有研究表明,哺乳動物FECH的(2Fe-2S)鐵簇受到NO的強烈抑制,NO可能抑制了豬肉中的FECH,從而抑制了ZnPP的形成[45]。

4 結語

肉制品中ZnPP的含量與其加工、成熟過程中的諸多因素有關,特別受加工時輔料的添加及成熟階段環境的影響。因此未來對于ZnPP生成技術的改良,可通過對不同影響因素的控制,分析出不同條件下的ZnPP形成的變化及不同因素之間的交互作用,設定適宜的加工參數提升產品中ZnPP的形成量,從而改善無硝肉制品的色澤。此外可在動物肝臟中分離提取FECH,將其應用于肉制品加工環節改善肉制品色澤;還可根據微生物發酵對于ZnPP形成的促進作用,將該技術應用于動物血制品的開發利用中,提取更加穩定的天然色素,提高血產品附加值。總之,在以后的研究中應依據企業的生產需求,與其他技術如微生物發酵技術、基因重組技術密切結合發揮ZnPP形成技術在食品產業中適用性。