烏雞肽中潛在功能活性肽段的研究

方磊,李詒光,陳亮,劉丹,王雨晴,廖群,張新雪,許錦珍,劉文君*,劉文穎*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015)2(江中藥業股份有限公司,江西 南昌,330096)

烏雞,又稱烏骨雞,是我國傳統滋補食材、藥材,具有補氣血、益肝腎等功效。烏雞肉中含有20種氨基酸、27種微量元素和多種脂肪酸,鮮肉中氨基酸含量較高,必需氨基酸齊全,且第一、二、三限制性氨基酸含量較高,營養價值較高,是典型的藥食同源原料[1-3]。烏雞富含微量元素,血液中所含γ球蛋白、血清酶類、血小板均高于普通雞。此外,還具有增加血紅素和血細胞、增強免疫力、調節生理機能的功能[4]。王勇[4]基于血虛小鼠模型評價了烏骨雞多肽的功能活性,發現其通過提高小鼠的紅細胞數和血紅蛋白含量發揮補血養血的作用。以烏雞為主藥的烏雞白鳳丸具有補養氣血、調經止帶的主要功效[5]。烏雞肽是烏雞肉蛋白經過蛋白酶酶解工藝優化,再經一定分離純化得到的多肽混合物,烏雞肽對5-氟尿嘧啶貧血模型有恢復作用,作用機制與烏雞肽促進促紅細胞生成素的表達、調節白細胞介素3及干擾素γ的表達有關[4]。但烏雞肽發揮補血養血作用的核心功能肽段目前尚不明確。因此,本研究以烏雞肽為考察對象,對烏雞肽的總蛋白、肽含量、氨基酸組成、分子質量分布以及潛在功能活性的特征肽段進行研究,為烏雞肽發揮補血養血作用和營養保健功能應用奠定理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏雞肽,北京中食海氏生物技術有限公司;低聚肽標準品:谷氨酰精氨酸二肽(glutyl-arginine dipeptide,ER)、異亮氨酰精氨酸二肽(isoleucyl-arginine,IR)、天冬酰胺酰精氨酸二肽(asparagyl-arginine,NR)、脯氨酰天冬氨酰精氨酸三肽(prolyl-aspartyl-arginine,PDR)、丙氨酰丙氨酰精氨酸三肽(alanyl-alanyl-arginine,AAR) (純度均≥99%),蘇州強耀生物科技有限公司;乙腈(色譜純),德國Merck公司;甲酸(色譜純),迪馬科技;蒸餾水,屈臣氏;其余藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

DU-20恒溫水浴鍋,上海一恒科學儀器有限公司;L-8900日立全自動氨基酸分析儀,天美(中國)科學儀器有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀、色譜儀Nexera X2、LCMS-8060三重四極桿質譜儀聯用系統(配有LabSolutions Ver.5.91色譜工作站),日本島津公司。

1.3 分子質量分布的測定

首先將烏雞肽用流動相配成1 mg/mL的溶液,經聚四氟乙烯過濾膜(孔徑0.2 μm)過濾后上樣分析,以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質量451)、桿菌酶(分子質量1 450)、細胞色素C(分子質量12 500)為肽標準品建立標準曲線,采用高效凝膠過濾色譜法測定分子質量的分布[6-7]。

1.4 烏雞肽蛋白和氨基酸組成測定

蛋白質含量測定按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》方法,氨基酸含量按照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》方法。

1.5 烏雞肽結構序列的鑒定

參照文獻[8-10]的液相色譜-三重四級桿串聯質譜法,將烏雞肽配制成20 μg/mL的水溶液,10 000 r/min離心10 min后取上清液,用0.22 μm孔徑的尼龍過濾膜過濾后,制得待測樣品。按照原創肽段數據庫進行產物離子掃描,將Inertsil ODS-3色譜柱連接在液相色譜儀,進樣體積10 μL。在正離子模式下,碰撞能量設置為-25 V和-35 V,將烏雞肽進行前體離子掃描(precursor ion scan,PIS),然后對碰撞后生成的產物離子進行分析。

烏雞肽肽段標準品經LCMS-8060進行Q3掃描、PIS掃描,多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)優化及肽段序列定量,MRM參數如表1所示。

表1 肽段序列的MRM優化參數

液相色譜條件:色譜柱:Inertsil ODS-3(2.1 mm×250 mm,5 μm);流動相A為純水(含0.1%甲酸),流動相B為100%乙腈(含0.1 %甲酸),流速0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～15 min,流動相B 0%～50%;15～20 min,流動相B 50%～100%;20～25 min,流動相B 100%;25.1～35 min,流動相B 0%;進樣體積10 μL;柱溫40 ℃。質譜條件:離子化模式:ESI,正離子模式;離子噴霧電壓+4.5 kV;霧化氣N23.0 L/min;加熱氣N2流速 10 L/min;干燥氣N2流速10 L/min;DL溫度250 ℃;加熱模塊溫度400 ℃;離子源溫度300 ℃;掃描模式MRM;駐留時間100 ms;延遲時間3 ms。

1.6 統計學處理

采用Origin 9軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 烏雞肽的蛋白質和氨基酸組成

烏雞肽中總蛋白質含量(干基,除去水分所占比例)為94.88%,肽含量(干基)為78.93%,其蛋白質和肽含量均較高。肽的基本組成單位是氨基酸,氨基酸的種類和含量對其功能活性有非常大的影響。從表2可知,烏雞肽含有17種氨基酸,其中含有人體必需的7種氨基酸和2種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸),其含量分別為25.25%和7.11%,對人體的營養價值較高。歐金秀等[11]采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定了驢膠補血顆粒中水解氨基酸,分別是谷氨酸[Glu(E)]、甘氨酸[Gly(G)]、丙氨酸[Ala(A)]、精氨酸[Arg(R)]、脯氨酸[Pro(P)]。張虹等[12]通過魚皮脫脂、脫雜蛋白處理制備魚皮明膠粗提物,經多孔型親水聚合物離子交換層析和葡聚糖柱色譜串聯分離得到活性組分,最終通過環磷酰胺致小鼠血虛模型,并使用高分辨的液相色譜串聯質譜技術鑒定出7條補血肽段,其中肽段序列中含有較多的Gly(G)、Pro(P)、Ala(A)。上述研究結果說明這些氨基酸可作為補血養血作用的優勢氨基酸,從而肽段發揮補血養血作用。此外,烏雞肽中Glu(E)、Ala(A)、天冬氨酸[Asp(D)]、Gly(G)、Arg(R)含量較高,有助于烏雞肽發揮補血養血作用,說明烏雞肽中也存在潛在的補血養血活性功能肽段。

表2 烏雞肽的氨基酸含量 單位:%

2.2 烏雞肽的分子質量分布

通過對圖1中色譜峰進行分析計算,得到烏雞肽的分子質量分布,結果如表3所示。

圖1 烏雞肽的凝膠色譜圖

表3 烏雞肽的分子質量分布

烏雞肽的分子質量1 000 Da以上的只有8.91%,主要分布在1 000 Da以下,占分子質量總量的91.04%,其中主要集中在189～1 000,重均分子質量為507.8 Da。相對分子質量的大小與肽的吸收速率有直接的關系。目前認為,分子質量1 000 Da以下的多數為二肽、三肽和四肽,二肽和三肽的轉運吸收存在獨立系統以及相應的載體,三肽以上的轉運機制還具有一定的爭議[13]。小分子多肽進入人體后不需要進行消化可直接被人體吸收,具有主動性、完整性和載體功能等特點,且吸收速度比游離氨基酸快,并具有氨基酸不可比擬的生理功能和改善食品感官的效應[14-16]。

2.3 烏雞肽的結構序列鑒定

原創肽段數據庫包含二肽及三肽的肽段前體離子信息,無需再對樣品進行分離純化和Q3掃描,可以縮短結構鑒定周期,基于原創肽段數據庫直接對烏雞肽進行PIS掃描,采集肽段的碎片離子信息,以便獲得其產物離子信息,若質譜圖解析后有對應的產物離子信息,說明烏雞肽中含有對應的肽段結構,結合已有文獻報道的具有補血養血肽段的氨基酸組成含有Glu(E)、Gly(G)、Ala(A)、Arg(R)、Pro(P)[11-12]的特點,以及天冬氨酸和天冬酰胺對補血養血也有重要作用,從中篩選潛在的功能活性肽段。

在正離子模式碰撞能量分別為-25 V和-35 V的條件下對肽段前體離子進行碰撞,然后對產物離子譜圖進行解析,以ER肽段為例說明,圖2-a譜圖解析后發現304.2是ER的前體離子,然后基于前體離子進一步碰撞得到產物離子譜圖,如圖2-b、圖2-c所示,102.1是E的亞胺離子、130.2是E的b1離子、175.4和158.4分別是R的y1離子和z1離子,從而確定烏雞肽樣品中存在ER肽段,同理其他肽段經譜圖解析共得到5條主要肽段序列,分別為Glu-Arg(ER)、Ile-Arg(IR)、Asn-Arg(NR)、Pro-Asp-Arg(PDR)、Ala-Ala-Arg(AAR)如表4所示。

a-前體離子;b、c-產物離子

表4 烏雞肽中鑒定出的5條肽段序列

利用高效液相色譜-串聯質譜法(high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)自動優化功能對標準品進行了定量離子對和電壓的優化,利用MRM優化參數對烏雞肽各肽段進行了定量,肽段定量色譜圖及校準曲線如圖3所示。根據表5中校準曲線計算各肽段含量,分別為ER(4.28 mg/g)、IR(0.61 mg/g)、NR(0.38 mg/g)、PDR(0.38 mg/g)、AAR(0.14 mg/g)。烏雞肽肽段含量大小為:ER>IR>PDR=NR>AAR。研究表明,細胞穿膜肽能夠穿過細胞膜或組織屏障達到細胞內部,大多數細胞穿膜肽都具有精氨酸結構,因為精氨酸的胍基在細胞穿膜肽表面提供正電荷,與細胞膜中帶負電荷的羧酸、磷酸基團能夠相互作用形成氫鍵,從而穿過細胞膜進入細胞,含有精氨酸的肽段可能具有較好的生物功能活性,并且是潛在細胞滲透肽和分子載體[17-18]。從烏雞肽中鑒定出的5條肽段的C端均有精氨酸殘基,可能具有分子載體的潛力作為細胞穿膜進入細胞,從而發揮生理活性作用。

a-肽段標準品定量色譜圖;b-烏雞肽定量色譜圖;c-校準曲線

表5 五條肽段的校準曲線方程

3 結論

烏雞肽的總蛋白含量為94.88%,肽含量(干基)為78.93%,氨基酸組成豐富,富含人體必需氨基酸和半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸);烏雞肽的分子質量<1 000 Da的肽段含量高達91.04%,以二肽和三肽為主;經超快速液相色譜串聯三重四極桿質譜對烏雞肽產物離子以及MRM優化進行掃描,并從中分離鑒定出5條潛在補血養血功能的肽段序列,包含3條二肽序列(ER、IR、NR)和2條三肽序列(PDR、AAR),為烏雞肽補血養血的營養保健應用提供了一定的理論支持,但對于這些肽段補血養血的作用機制尚需進一步探討。