超聲輔助酶提取技術(shù)對駝皮源膠原蛋白降解及其活性肽的影響

何靜,史睿,吉日木圖,2*

目前,從各種食物中提取生物活性肽已成為研究的一個熱點(diǎn),尤其是從食物中提取的生物活性肽由于其高組織親和力和特異性,且無副作用,并有潛力作為藥物的天然替代品而受到關(guān)注[1]。生物活性肽一般是由2～20個氨基酸分子通過肽鍵相互連接而成,是蛋白質(zhì)水解后的片段,分子質(zhì)量大多數(shù)在3 kDa以下,是對機(jī)體生命活動有益或者具有一定生物活性的肽類化合物[2]。這些生物活性肽已被證明具有抗糖尿病、降壓、抗菌、抗氧化等功效[3-4]。生物活性肽常常隱藏于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列中的一些特定區(qū)域內(nèi),必須釋放它們才能發(fā)揮作用。目前,常用于獲取生物活性肽的方法包括微生物發(fā)酵法、胃腸道消化酶法和蛋白酶水解法等,特別是通過體外消化釋放多肽已被證實(shí)是一種有效提高食物蛋白生物活性的良好途徑[5]。已有研究證實(shí)通過模擬體外消化實(shí)驗(yàn)獲得的多肽與人體蛋白消化過程釋放多肽結(jié)果更相似[6]。因此,采用該方法可更有效預(yù)測功能蛋白及其蛋白肽的生物活性。

傳統(tǒng)的生物活性肽篩選方法主要通過分離純化,結(jié)合體內(nèi)外活性評價進(jìn)行肽段的確定,整個過程費(fèi)時、費(fèi)力且技術(shù)難度大。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助酶法技術(shù),通過在線數(shù)據(jù)及虛擬篩選手段研究肽的活性,能夠快速高效地從中發(fā)現(xiàn)和預(yù)測具有較高生物活性的肽段,并能夠減少工作強(qiáng)度,提高鑒定成功率[7]。先前已有學(xué)者通過虛擬篩選,在線預(yù)測了多肽的活性、吸收、代謝和毒性等,從雞蛋、稻米、啤酒等中鑒定出血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和二肽基肽酶抑制劑-Ⅳ(dipeptidyl peptidases inhibitor-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽[8-10]。因此,本研究采用一系列生物信息學(xué)方法,從駝皮膠原蛋白模擬胃腸道消化產(chǎn)物中篩選生物活性肽,為駝皮膠原蛋白生物活性肽篩選提供新思路。

膠原蛋白肽是以膠原蛋白或明膠為原料,在酶的作用下得到的水解產(chǎn)物。與膠原蛋白相比,低分子質(zhì)量的膠原蛋白肽具有更強(qiáng)的生物活性,如抗氧化、抑菌、降血壓、抗炎等特性[11-12]。動物源性農(nóng)副產(chǎn)品產(chǎn)量巨大,膠原蛋白資源豐富,但利用率不高,深加工工藝亟待優(yōu)化。對于駱駝產(chǎn)業(yè)而言,如何合理利用駝皮得到膠原蛋白及其衍生產(chǎn)品,從而減少廢料造成的環(huán)境污染和增加駱駝的經(jīng)濟(jì)附加值是目前值得關(guān)注的問題。但是,目前關(guān)于駝皮膠原蛋白方面的研究較少,本課題組前期證實(shí)低強(qiáng)度超聲波輔助酶法可有效提高膠原蛋白的提取率[13]。因此,本研究以不同方法提取獲得的駝皮膠原蛋白為研究對象,通過體外模擬胃腸消化獲得更貼近人體真正消化產(chǎn)物的膠原蛋白多肽,并采用計(jì)算機(jī)模擬法探究其生物活性,以期為功能活性肽的開發(fā)及駱駝皮副產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5歲膳駝的皮購買于阿拉善右旗當(dāng)?shù)赝涝讏觥Ｎ傅鞍酌?1∶10 000),北京索萊寶科技有限公司;中性蛋白酶(1398),山東龍?jiān)锕こ逃邢薰?豬胃蛋白酶(P6887-250MG)、豬胰蛋白酶(T0303-1G)、NH4HCO3(生化純),美國Sigma公司;純水、乙腈、甲酸、三氟乙酸(triuoroacetic acid,TFA)(均為質(zhì)譜純),美國Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY 88-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;JJ-2型組織搗碎機(jī),常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠;XK78-2型磁力加熱攪拌器,江蘇新康醫(yī)療器械有限公司;Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀,英國馬爾文儀器有限公司;Q-Exactive 質(zhì)譜儀,美國Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 駝皮膠原蛋白提取

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前期的駝皮膠原蛋白的提取方法[13],具體操作如下:駱駝皮經(jīng)過脫毛、脫脂、去除雜蛋白等處理后,將0.5 mol/L乙酸和預(yù)處理的皮膚組織與質(zhì)量濃度為40 g/L的胃蛋白酶以1∶20的比例混合,制成勻漿液。稱取一定質(zhì)量的上述勻漿液,采用常規(guī)酶法提取[加入胃蛋白酶于0.5 mol/L乙酸溶液,(pepsin soluble collagen,PSC)]/超聲波輔助法提取[酶法基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲波,條件:200 W,20 min,(ultrasound-pepsin soluble collagen,UPSC)],在低溫條件攪拌提取48 h后,以8 000 r/min離心20 min,收集上清液,得到駝皮膠原蛋白提取液。經(jīng)冷凍干燥得到駱駝皮中膠原蛋白,制備膠原蛋白酶解物前在90 ℃熱解2 h處理。

1.3.2 模擬體外消化

模擬胃消化道:分別取250 mg PSC和UPSC凍干樣品,溶解于25 mL水中。取2 g NaCl,加7 mL濃HCl溶液,用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至3,用水定容至1 L。加入豬胃蛋白酶(0.008 mg/mL),使其充分溶解,得到模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF)。取25 mL樣品溶液與25 mL SGF混合,在恒溫?fù)u床振蕩2 h(37 ℃,100 r/min)。每間隔30 min(0、30、60、90、120 min)取樣,所取樣品調(diào)pH值至7終止反應(yīng)。

模擬腸消化道:取6.8 g KH2PO4于250 mL水中溶解,加入0.2 mol/L NaOH溶液77 mL,溶于500 mL水中,再用0.2 mol/L HCl將溶液pH值調(diào)至6.8。加入膽鹽(0.2 mg/mL)、胰蛋白酶(0.003 mg/mL)溶于上述溶液,使其充分溶解,得到模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF)。將模擬胃消化2 h后的消化液與SIF等體積混合后,置于37 ℃的恒溫?fù)u床振蕩繼續(xù)消化2 h。每間隔30 min(30、60、90、120 min)取樣,將所取樣品煮沸10 min終止反應(yīng)。

1.3.3 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE分析法分析PSC和UPSC。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的分離膠體系進(jìn)行電泳分離,用0.5 mol/L的乙酸將樣品配制成0.5 mg/mL的膠原蛋白溶液,上樣量為5 μL。分別采用濃縮膠電壓80 V、分離膠電壓100 V進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后,使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色膠片,并用乙醇-乙酸脫色液進(jìn)行脫色,最后使用凝膠成像儀觀察分析。

1.3.4 粒徑分析

采用激光粒度儀測定樣品的粒徑大小及分布情況,測定的相關(guān)參數(shù):物質(zhì)折光率為1.59,介質(zhì)折射率為1.333。

1.3.5 肽段檢測

超濾脫鹽:樣品用Millipore 10 kDa超濾管超濾,得到的多肽混合物用Empore固相萃取小柱C18脫鹽,多肽組分真空冷凍干燥后用40 μL體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA復(fù)溶,進(jìn)行LC-MS/MS分析。

色譜條件:色譜柱:Zorbax 300SB-C18 peptide traps,進(jìn)樣量2 μL,流速為250 nL/min。流動相:A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸-乙腈溶液。液相梯度設(shè)置如下:0～50 min,B相線性梯度從4%～50%;50～54 min,B相線性梯度從50%～100%;54～60 min,B液維持在100%。該過程以95%的A液進(jìn)行平衡。

質(zhì)譜條件:采用正離子源,噴霧電壓為3.2 kV;數(shù)據(jù)采集范圍:300～1 800m/z;質(zhì)譜掃描模式為Full MS-ddMS2,一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的分辨率分別為70 000(m/z200處)和17 500(m/z200處)。

數(shù)據(jù)庫檢索參數(shù):Peptide mass tolerance:20 ppm;MS/MS tolerance:0.1 Da;Enzyme=None;Max Missed Cleavages:2;Variable modification:Oxidatio;數(shù)據(jù)庫選用UniProt_camelidae_89471_20201019(數(shù)據(jù)庫包含89 471條序列,下載于2020年10月19日)并結(jié)合反庫;結(jié)果過濾參數(shù):FDR<0.01。

1.3.6 駝源膠原蛋白活性肽的初篩

1.3.6.1 消化產(chǎn)物中生物活性肽的篩選

使用PeptideRanker程序?qū)ι鲜鍪占亩嚯倪M(jìn)行生物活性預(yù)測,并以預(yù)測得分的形式表示其生物活性的相對大小。以0.5作為活性預(yù)測的閾值,當(dāng)多肽得分大于該值時,認(rèn)為其具有潛在的生物活性[14]。

1.3.6.2 消化產(chǎn)物的性質(zhì)分析

本研究使用 admetSAR(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)程序?qū)λx活性肽進(jìn)行在線評價, 選擇人體腸道吸收(human intestinal absorption, HIA)來確定吸收特性,選擇血腦屏障(blood brain barrier, BBB)穿透率和細(xì)胞色素 P450(CYP 450)和急性口服毒性做為評價指標(biāo)[15]。

1.3.7 分子對接

從RCSB PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)檢索得 ACE 靶點(diǎn)蛋白(PDB ID:1o86)和靶點(diǎn)蛋白DPP-IV(PDB ID:5 J3 J)晶體結(jié)構(gòu)。在對接前去除水分子,加氫,加電荷優(yōu)化的預(yù)處理,選擇蛋白分子為受體。利用Chem Draw 軟件(Cambridge Soft Co., Boston, MA, U.S.A)繪制多肽分子結(jié)構(gòu),在對接前進(jìn)行能量最小化。使用autodock、pymol 軟件(De Lano Scientific LLC, San Carlos, CA, USA)進(jìn)行分子模擬對接研究[16-17]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用軟件 Origin Pro 8繪圖。使用Proteins Plus(https://proteins.plus/)用于展示受體和配體之間的2D作用模型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

為了解PSC和UPSC經(jīng)模擬胃腸消化后的水解情況,使用SDS-PAGE對不同消化時間PSC和UPSC的水解程度進(jìn)行表征。根據(jù)圖1觀察可知,二者在模擬胃消化階段中,消化時長在60 min內(nèi),膠原蛋白的主要條帶仍然可見,當(dāng)消化120 min時,β和γ鏈幾乎被完全水解,僅在135 kDa附近的條帶較明顯。在消化過程中,隨著時間的延長,50 kDa以下的蛋白條帶逐漸變深,說明α、β和γ鏈均被水解為較小分子質(zhì)量的肽。在開始模擬腸消化30 min后,PSC和UPSC在15%的分離膠上已無明顯條帶。

a-PSC;b-UPSC

2.2 粒徑分析

圖2顯示了在模擬胃腸消化過程中,PSC和UPSC的粒徑逐漸變小。在模擬胃消化2 h后,PSC組中大顆粒組分由40～355 μm變?yōu)?8～200 μm。隨后的模擬腸消化階段,大顆粒組分最終在25～140 μm。UPSC與PSC在模擬消化各階段具有相似的變化規(guī)律,經(jīng)過模擬腸消化階段后,二者消化產(chǎn)物的粒徑大小相似,但UPSC較PSC的粒徑更小。

a-PSC;b-UPSC

2.3 肽段分析

由圖3可知,PSC和UPSC組分別鑒定出101和138種多肽。與PSC消化產(chǎn)物相比,經(jīng)過超聲波處理后含有的多肽數(shù)量更多,說明超聲波可使膠原蛋白結(jié)構(gòu)更加松散,促進(jìn)水解,使其在消化后可得到更多數(shù)量的多肽。由圖2所示,PSC和UPSC組經(jīng)過胃腸消化后多肽的分子質(zhì)量主要集中在500～2 000 Da,尤其在1 000～1 500 Da數(shù)量最多,分別為47和62。此外本研究結(jié)果顯示,在UPSC組鑒定出<500 Da的多肽數(shù)量更多,表明經(jīng)過超聲波處理后,膠原蛋白可釋放出大量的短肽。

圖3 UPSC和PSC不同分子質(zhì)量下的肽段數(shù)量

2.4 消化產(chǎn)物中生物活性肽評價

本研究通過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化以及水解后,主要I型膠原蛋白分解釋放的肽片段。通過PeptideRanker程序?qū)οa(chǎn)生的生物活性肽打分,得分大于0.5且低于15個氨基酸的的多肽有56條,其中十肽8條,十一肽11條,十三肽8條,活性肽分子質(zhì)量主要集中在小于1 500 Da。由表1可知,PSC組包含31條生物活性肽,UPSC組包含47條生物活性肽。該結(jié)果表明,超聲波處理對于膠原蛋白提供生物活性肽具有良好的潛力。

表1 UPSC和PSC膠原蛋白水解肽活性評價

2.5 肽段的性質(zhì)分析

本研究采用admetSAR 2.0數(shù)據(jù)庫對篩選的生物活性肽段的吸收、代謝、毒性進(jìn)行預(yù)測。只有通過胃腸道吸收并透過生理屏障后活性肽才能在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮功能活性從而促進(jìn)人體健康[18]。據(jù)報道口服小分子活性肽主要通過胃腸吸收,活性肽的HIA性有助于預(yù)測其通過小腸的吸收率,人體的小腸吸收率≤30%時,HIA值為負(fù)數(shù),反之為正數(shù)[19]。與其他膜屏障相比,血腦屏障是通過形成通透屏障而嚴(yán)格限制化合物的滲透,許多化合物和靶向藥物由于無法在腦組織中達(dá)到足夠濃度而不能產(chǎn)生期望的治療作用[20]。如表2所示,本研究通過預(yù)測,獲得5條既能通過胃腸道吸收也能通過血腦屏障的肽段,其中1條較長肽來源于傳統(tǒng)提取法獲得,其余肽均來源于超聲輔助提取法所獲得。

表2 膠原蛋白肽段的性質(zhì)分析

CYP450是代謝過程中關(guān)鍵的酶,主要分布于肝臟中,少部分分布于腸、肺、腎、腦中,其主要通過參與內(nèi)源性物質(zhì)的生物合成和代謝及外源性物質(zhì)的生物氧化和降解[21]。為了探究肽段的代謝速度,本研究選擇CYP450綜合抑制率作為指標(biāo)。預(yù)測結(jié)果顯示上述5條肽段綜合抑制率均為負(fù)數(shù),表明所選肽段能提高CYP酶系的活性,有效加快肽段在體內(nèi)的代謝速度。此外,本研究選擇急性口服毒性指標(biāo)分析所選肽段的毒性預(yù)測指標(biāo),結(jié)果表明5條肽段急性口服毒性均為三級毒性,毒性低[22]。

2.6 ACE抑制肽的虛擬篩選

分子對接是研究分子間相互作用,并預(yù)測其結(jié)合模式和結(jié)合力的常用方法。與蛋白酶活性部位的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合并產(chǎn)生相互作用是生物活性肽發(fā)揮蛋白酶抑制活性的前提[23]。為了進(jìn)一步篩選具有較高抑制ACE抑制活性的肽段,本研究進(jìn)行分子對接模擬,評價篩選的3條寡肽與ACE結(jié)合能力。據(jù)報道,自由能越低,多肽與ACE的結(jié)合作用力越強(qiáng);此外,氫鍵相互作用在穩(wěn)定對接復(fù)合體和酶催化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,氫鍵的數(shù)目直接影響降壓活性肽對ACE的親和力[24]。如表3所示,3條寡肽與降壓靶標(biāo)ACE發(fā)生不同程度的結(jié)合,具有潛在的ACE抑制活性,其中LSFLF與ACE表現(xiàn)出最強(qiáng)的結(jié)合力,且形成的氫鍵數(shù)量最多。

表3 ACE抑制肽的篩選

ACE是一種含鋅離子的二肽羧基酶,其活性中心由3個疏水腔組,腔中有鋅離子。目前的研究表明三肽對ACE的抑制作用主要是由氫鍵相互作用及配體與活性部位鋅離子的相互作用主導(dǎo)[25-26]。本研究虛擬篩選得到的3個寡肽均能嵌入ACE的活性口袋中,均能與ACE活性部位的關(guān)鍵氨基酸殘基形成分子間相互作用而產(chǎn)生抑制作用。如圖4所示,與ACE的結(jié)合中,LSFLF與Glu384A,Ala356A,Asn66A,Ser516A,Tyr62A,Arg124A形成氫鍵作用,同時可與Trp357形成π-π鍵作用,使其在ACE的活性部位空腔中更為穩(wěn)定地結(jié)合。

a-3D圖;b-2D圖

3 結(jié)論

傳統(tǒng)酶法提取和超聲輔助酶法提取技術(shù)均能使膠原蛋白發(fā)生水解,但是超聲輔助酶法技術(shù)對膠原蛋白的降解程度更高。經(jīng)過模擬胃腸道消化后,超聲波處理后活性肽的數(shù)量增加,且肽段大部分集中于1 500 Da以下。通過ADMET生物活性預(yù)測,發(fā)現(xiàn)5條潛在具有ACE抑制作用的肽段。通過分子對接技術(shù)進(jìn)一步虛擬篩選發(fā)現(xiàn),超聲輔助酶法獲得的肽段LSFLF可能具有較高潛力ACE抑制作用,其主要通過與氨基酸殘基形成氫鍵進(jìn)行抑制ACE的活性。該研究結(jié)果證實(shí)超聲輔助酶法提取技術(shù)能促進(jìn)駝皮膠原蛋白質(zhì)降解,可能釋放生物活性多肽,該結(jié)果可為駝皮深度開發(fā)活性肽的高價值利用提供理論參考。