大豆蛋白部分替代牛乳蛋白對酸奶理化性質及結構的影響

惠丹陽,華舒雨,唐裕芳,劉忠義,劉文星

(湘潭大學 化工學院,湖南 湘潭,411105)

我國是世界上的大豆生產大國,大豆蛋白是我國食用蛋白質的重要來源之一,如果能用大豆蛋白替代牛乳蛋白制備雙蛋白酸奶,既可以增加大豆的消費途徑,也可以提供高營養價值的酸奶供消費者選擇。

近年來,國內外植物基酸奶[1-2]發展迅速,我國大豆酸奶市場初具雛形,大豆酸奶仍是小眾飲品,且當前只有少數的大豆酸奶品牌供消費者選擇,常溫大豆酸奶產品非常稀少,大豆酸奶功能性質及其凝乳形成機制還需深入研究,大豆酸奶主要存在豆腥味和凝乳貯藏穩定性比較差等問題。降低豆腥味的方法包括添加化學試劑法、熱處理法、微生物發酵法、酶分解法、氣味掩蓋法等[3-5],貯藏穩定性可以通過調節儲藏溫度、添加食品增稠劑、高壓均質處理、選擇合適的發酵劑[6-8]等方法得以改善。盡管有這么多方法可供選用,依然沒有很好解決豆基酸奶的豆腥味及貯藏穩定性的問題。

本文試采用大豆蛋白與牛乳混合發酵制作酸奶的方法,期望改善豆基酸奶的品質和貯藏穩定性,同時緩解我國牛奶供應不足的問題,并探討大豆蛋白和奶酪蛋白是否可以形成穩定的混合凝乳結構,在研究方法上,同時將理化性質和微觀結構等結合起來,較為全面地研究用大豆蛋白部分替代牛乳蛋白對酸奶品質的影響及酸奶結構變化,期望為雙蛋白酸奶的研究開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:安佳全脂奶粉、安佳脫脂奶粉,恒天然集團;白砂糖,華坊城食品有限公司;混合發酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌),北京川秀國際貿易有限公司;大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI),臨沂山松生物制品有限公司;原料均為食品級。

試劑:考馬斯亮藍G250,天津市光復精細化工研究所;ANS熒光探針、NaOH,上海麥克林生化科技有限公司;其他化學試劑均為分析純或者生化試劑。

1.2 儀器與設備

MYP11-2磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;SPX-250B-D振蕩培養箱,上海博遠實業有限公司;BAS224S電子天平,賽多利斯科技有限公司;CLT-1A電熱套,韓西儀器科技有限公司;ZD-2自動電位滴定儀,上海康儀儀器有限公司;UV-VIS紫外分光光度計,美國安捷倫科技有限公司;DL-6M冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;Universal TA質構儀,上海騰拔儀器科技有限公司;MIRA3 TESCAN電子掃描顯微鏡,北京亞科晨旭科技有限公司;Zetasizer nano ZS90電位粒度儀,英國馬爾文儀器公司;F97 pro熒光分光光度計,上海棱光技術有限公司;NICOLET 380傅里葉紅外光譜儀,美國尼高力公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆蛋白酸奶樣品的制備

1.3.1.1 工藝流程

工藝流程如圖1所示。

圖1 大豆蛋白酸奶發酵工藝流程

1.3.1.2 樣品的制備

普通酸奶制備:參考吳小艷[9]的酸奶配方制備酸奶,準確稱取6.25 g全脂奶粉、5 g脫脂奶粉、8 g蔗糖溶解于88.75 mL去離子水中,磁力攪拌1 min,95 ℃殺菌5 min,冷卻后接種0.1 g菌粉,43 ℃培養10 h,冷卻后磁力攪拌1 min,4 ℃冰箱后熟24 h,制得沒有大豆蛋白的酸奶,作為實驗對照組記SPI0。

SPI酸奶的制備:保持蛋白質含量3.15%不變,用SPI替代牛乳中不同量(分別為10%、20%、30%、40%、50%,質量分數)的脫脂奶粉,被替代的奶粉的其他成分統一用乳糖代替,SPI加水混合均質后100 ℃熱處理15 min,其他物料加水混合均質后與SPI溶液混合,95 ℃殺菌5 min,冷卻后接種0.1 g菌粉,43 ℃培養10 h,冷卻后磁力攪拌1 min,4 ℃冰箱后熟24 h后制得SPI酸奶,記不同替代量的酸奶分別為SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。

1.3.2 pH和滴定酸度值的測定

酸奶樣品經發酵后熟取出恢復至室溫,取10 g樣品攪拌均勻,直接用ZD-2自動電位滴定儀測定樣品pH值。

酸奶樣品的滴定酸度值的測定參考GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》中發酵乳酸度的測定方法。測定與pH同時進行。

1.3.3 持水力的測定

參考文獻[10],稱取m1為空離心管的質量,加入10 g左右酸奶稱取總質量記為m2,在4 ℃下,在5 000 r/min的轉速下離心30 min,棄上清液后的質量記為m3,持水力計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.4 色度的測定

使用Ultrascan pro型色差計進行測定[11],直接讀取L*、a*、b*。其中,L*表示亮度,L*=0 表示黑色,L*=100表示白色;+a*表示色度偏紅,a*值越大,越接近紅,-a*表示色度偏綠,a*值越小,越接近綠;b*值越大,越接近黃,b*值越小越接近藍。

(2)

1.3.5 酸奶質構特性的測定

參考吳小艷等[12]的方法,取適量酸奶,使用Universal TA質構儀,選取P/BE中直徑為35 mm的壓力盤。設置測定參數為:下降速度和測試速度均為1.0 mm/s,提升速度10.0 mm/s,測試深度15.0 mm,測定硬度、黏性、彈性、咀嚼性、膠著性、黏聚性、回復性。

1.3.6 微觀結構的測定

參考吳小艷等[12]的方法,將在4 ℃下貯藏的酸奶樣品均勻薄涂在培養皿內壁上,在液氮中冷凍后迅速放入真空冷凍干燥機中進行干燥處理,然后采用離子濺射方法鍍金,而后進行掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)制片,最后在10 kV電壓和放大2 000×的倍率下進行觀察并采集圖像。

1.3.7 Zeta電位與粒徑的測定

Zeta電位測定:采用Zeta電位儀來測定酸奶樣品的Zeta電位[13]。將提前制備好并冷藏12 h的酸奶樣品取出,充分攪拌均勻后,用去離子水稀釋100倍制備混合液樣品待測。取適量樣品于樣品池中,運行Zeta電位測定系統,溫度設定為25 ℃,分散劑設定為水(粒徑測試條件同上)。

粒徑測定:取出稀釋100倍的樣品混合液倒進石英比色皿中,樣品約占石英比色皿的1/3,擦凈外表面后放進電位儀中,運行粒徑測試程序。

1.3.8 表面疏水性的測定

酸奶表面疏水性的測定參考劉鵬等[13]采用的ANS熒光探針法測定蛋白質表面疏水性。稱取酸奶樣品1 g溶于磷酸鹽緩沖液中,均質后于7 000 r/min離心20 min,取上清液用pH 7.0的0.01 mol/L 磷酸鹽溶液分別稀釋蛋白質量濃度0.1～0.5 mg/mL,取2 mL不同濃度的樣品溶液,分別加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液,搖勻靜置2 min,用熒光分光光度計測定樣品熒光強度,設置激發波長為396 nm,檢驗發射波長為483 nm時的熒光強度。用熒光強度對蛋白質溶液濃度做圖并進行線性回歸,初始斜率即蛋白質的表面疏水性。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析

取適量酸奶樣品放入超低溫冰箱冷凍后凍干12 h,用研缽磨成粉,將處理后的酸奶粉末樣品用KBr壓片,用FTIR儀進行掃描。設置條件如下[14]:25 ℃測定波長掃描范圍為4 000～400 cm-1的吸收光譜,分辨率4 cm-1,掃描次數8次。將掃描得到的圖譜用Omnic軟件校正后,用PeakFit Version4.12軟件對酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1波段的圖譜進行分析,基線矯正后進行高斯去卷積處理,再求二階導數曲線擬合,直至擬合相關系數R2≥0.996不變為止,使得疊加的各子峰得以分辨,得出各個二級結構分布圖,根據峰面積計算各二級結構組分的比例。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3次,取平均值,用Origin 8.6和SPSS 17.0軟件進行統計和方差分析(analysis of variance,ANOVA),用Duncan法進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,本文所有表格中的數據呈現形式:平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 SPI替代牛乳蛋白對酸奶pH和滴定酸度的影響

SPI替代牛乳蛋白的酸奶pH和滴定酸度變化如圖2、圖3所示。酸奶的滴定酸度呈下降趨勢(P<0.05)。當達到發酵終點時,對照組SPI0的酸度值為82.62 °T,此時酸味適中,符合大眾口味。隨SPI替代量從10%增加到50%時,酸奶的滴定酸度值呈先增加后下降的趨勢,SPI5發酵終點時的酸度值為64.96 °T,顯著低于SPI0(P<0.05)。

圖2 SPI替代牛乳蛋白對酸奶滴定酸度的影響

圖3 SPI替代牛乳蛋白對酸奶pH的影響

由圖3可知,SPI替代牛乳蛋白對酸奶的pH無明顯影響。普通酸奶與SPI4、SPI5的pH相同均為4.48,略低于SPI1的pH值,略高于SPI2與SPI3的pH值,整體來看,無顯著性差異(P>0.05)。用SPI 替代牛乳蛋白對酸奶酸度的影響主要是由于外源蛋白(SPI)的添加使酸奶體系緩沖能力減小[15],因而酸度值也減小。

2.2 SPI替代牛乳蛋白對酸奶持水力的影響

圖4顯示了對照組酸奶與SPI替代不同牛乳蛋白量的酸奶在后熟24 h后的持水力呈持續增加態勢(P<0.05)。SPI0的持水力為48%,而隨著SPI替代量的增加,酸奶的持水力一直增加。當SPI替代量增加到50%時,SPI5持水力為59.17%,顯著高于與對照組(P<0.05),因此用SPI替代部分牛乳蛋白可以有效提高酸奶的持水力。

圖4 SPI替代牛乳蛋白對酸奶持水力的影響

推測酸奶持水率提高的原因,一是可能與體系中存在的蛋白質本身的結構和性質之間的差異有關;二是SPI經過熱處理后,其中的蛋白質(主要是7 s和11 s組分)發生變性,伴隨著分子結構的重排,蛋白質分子之間形成可溶性的復合體;隨著乳酸菌發酵產酸,變性的蛋白質分子表面的負電荷被中和,導致蛋白質復合體之間的靜電排斥作用降低,而后這些復合體通過疏水作用相互聚集形成凝膠。YANG等[16]提出,添加SPI的酸奶其空間結構是一種緊密、剛性的結構,因為添加SPI可能會導致酸奶凝膠結構更加緊密,蛋白膠束間連接作用增強,從而導致持水率升高;也有研究者認為在大豆酸奶中發揮重要作用的凝膠網絡結構主要是通過氫鍵、疏水作用和離子橋連接而成,而二硫鍵并沒有發生大的變化[17]。

2.3 SPI替代牛乳蛋白對酸奶色澤的影響

酸奶的色澤主要受使用原料的顏色與形成的凝膠結構這2個因素的影響。用不同量的SPI替代牛乳蛋白制備酸奶的色澤如表1所示。從SPI0到SPI5,反映酸奶白度的L*呈下降趨勢,說明用SPI替代使酸奶顏色不斷變暗;反映酸奶紅度的a*值均為負值且不斷增大,說明用SPI替代使得酸奶的紅色消褪;反映酸奶藍度的b*值都是正值且不斷降低,說明用SPI替代會使酸奶的藍色減弱。隨著SPI替代量的逐漸增大,酸奶之間的顏色差異逐漸增大,ΔE值不斷增大(P<0.05)。

表1 為用SPI替代牛乳蛋白制備的酸奶樣品的色差值

ΔE值反映樣品的總色差,當SPI替代10%～20%,SPI酸奶顏色亮度略微高于普通酸奶,這可能是因為大豆蛋白的添加使酸奶的凝膠結構發生變化,酪蛋白微粒和大豆球蛋白經過發酵聚集形成的凝膠具有較強的光散射特性。SPI3的顏色幾乎與SPI0相近,這是由于大豆蛋白本身顏色為暗黃色使酸奶亮度變低,而SPI酸奶凝膠結構變化使酸奶亮度提高,2種因素作用相抵。當SPI替代40%～50%時,SPI酸奶凝膠結構對其亮度的提升有限,而SPI替代量增大,其本身顏色對酸奶色澤影響也逐漸增大,因此酸奶顏色不斷變暗。

2.4 SPI替代牛乳蛋白對酸奶質構特性的影響

表2為SPI替代牛乳蛋白的酸奶質構指標測定結果。與對照組相比,用SPI替代牛乳蛋白的酸奶的硬度、黏性、彈性、黏聚性、咀嚼性等均有所變化。其中,酸奶硬度、黏性、咀嚼性和膠著性均隨著SPI替代量的增大呈現遞增規律,而彈性、黏聚性均略高于對照組,回復性無明顯規律。當SPI替代量在10%～50%時,SPI酸奶的硬度、黏性、咀嚼性和膠著性呈現遞增趨勢,40%～50%的SPI酸奶硬度高于對照組(P<0.05),30%～50%的SPI酸奶黏性、膠著性高于對照組(P<0.05),10%～50%的SPI酸奶咀嚼性均高于對照組(P<0.05)。這可能是由于發酵過程中,大豆蛋白與酪蛋白發生相互作用,促進了氫鍵、疏水作用和離子橋的連接,形成了比只有酪蛋白更加緊密的復合網絡結構。有研究表明酸奶凝乳[18]主要是由蛋白質互相連接形成復雜的三維凝膠網絡結構。在發酵過程中,2種蛋白質相互交聯形成了一種致密的凝膠網絡,使酸奶凝乳結構更加穩定,改善并提高了酸奶的質構特性。

表2 SPI替代牛乳蛋白對酸奶質構特性的影響

2.5 SPI替代牛乳蛋白對酸奶微觀結構的影響

圖5為在2 000倍電鏡視野中酸奶的微觀結構圖。普通酸奶微觀結構是一種三維網狀體結構,這種網狀結構中間有無數有規則的孔隙,而與普通酸奶一樣,SPI替代的酸奶樣品也呈現清晰的三維網絡結構。隨著SPI替代量的增加,酸奶的結構更加緊密,相比普通酸奶孔隙明顯變少。SPI1和SPI2酸奶與對照組SPI0一樣表現出相對均勻細膩且開放疏松的凝膠網絡結構,SPI3明顯均一性變差,結構變的略微緊密。而SPI4和SPI5的酸奶微觀結構則明顯更加緊密和堅硬,但結構均一性較差且出現較大的蛋白聚集,更趨向于豆腐凝膠的質地。這與質構特性的結果一致。

a-SPI0;b-SPI1;c-SPI2;d-SPI3;e-SPI4;f-SPI5

究其原因,一方面可能是因為大豆蛋白亞基分子質量大,若大豆蛋白參與凝膠的量多到一定程度時,就會形成更堅硬的膠體;另一方面可能是因為在酸奶的凝膠體系中,大豆蛋白過多可能取代了酪蛋白在凝膠網絡中的主導作用,此時大豆蛋白是起主要作用的基質,而含更多物理化學鍵或更高級結構的大豆蛋白凝膠可以更好地將水分包裹在網絡結構中。總體而言,可以看出添加適量的大豆蛋白可以改善大豆酸奶的微觀結構,形成緊密且均一性也特別好的多孔凝膠網絡結構。

2.6 SPI替代牛乳蛋白對酸奶粒徑與電位的影響

圖6反映了用SPI替代牛乳蛋白的酸奶粒徑變化。隨著SPI替代量的增加,酸奶粒徑也不斷增大(P<0.05),SPI1的酸奶粒徑比對照組SPI0增加了近一倍,繼續增加替代量,酸奶的粒徑也繼續增大。這可能是由于大豆蛋白的分子質量大于酪蛋白的分子質量[19],大豆蛋白更易形成更大的聚集體,因此導致酸奶粒徑不斷增大且使得酸奶質地較硬[20],這與所測得的質構變化及微觀結構的觀察結果也是一致的。

圖6 SPI替代牛乳蛋白對粒徑的影響

圖7為用SPI替代牛乳蛋白的酸奶的Zeta電位變化圖。Zeta電位絕對值的大小反映著所測體系穩定性的強弱。當用SPI替代牛奶蛋白質時,酸奶的Zeta電位是隨SPI替代量的增加而增大。對照組的Zeta電位值為7.14 mV,此時酸奶體系中的酪蛋白膠束帶正電,這是因為牛奶在乳酸菌作用下發酵成酸奶后,體系環境會由中性逐漸變成酸性,體系中氫離子逐漸增多,導致酪蛋白表面帶正電荷。而隨著SPI替代量的增加,Zeta電位絕對值也增大,酸奶體系穩定性增強。這可能是因為大豆蛋白與酪蛋白產生復合,而復合物之間可能同時存在著靜電引力和靜電斥力以及范德華力,這幾種力的相互作用,使酸奶保持較為穩定的平衡狀態。GRYGORCZYK等[21]發現如酪蛋白先變性聚集,酪蛋白凝膠網絡就包裹作為填充顆粒的大豆蛋白從而形成聚集體,若兩者同時變性聚集就可與整體的凝膠網絡中均勻分布,這也證實了大豆蛋白與酪蛋白確實產生了相互作用。

圖7 SPI替代牛乳蛋白對電位的影響

2.7 SPI替代牛乳蛋白對酸奶表面疏水性的影響

蛋白質表面疏水性指標是表征蛋白質表面非共價作用的一個重要定量指標,反映酸奶內分子表面疏水性基團的相對含量,當蛋白質變性、結構或構象發生改變時,蛋白質的表面疏水性會相應產生某種程度的變化[22-23]。由圖8可知,酸奶表面疏水性隨SPI替代量的增加呈波動下降趨勢,SPI5的表面疏水性與對照組有明顯差異。一是由于酪蛋白本身疏水性高于大豆蛋白,用SPI替代牛乳蛋白使得整個酸奶體系疏水性下降;二是SPI含量的增多使酸奶體系中的SPI基團中的亞基之間形成了更多的蛋白質聚集體,因此疏水基團隱藏在蛋白聚集體內部使表面疏水性發生了一定程度的下降。

圖8 SPI替代牛乳蛋白對酸奶表面疏水性的影響

2.8 SPI替代牛乳蛋白對酸奶二級結構的影響

依據紅外譜圖(圖略),隨著SPI替代量的增大,與對照組相比,紅外光譜的特征峰吸收略微增強,這表明酸奶中的蛋白結構發生了改變或轉化。

參考LONG等[24]的研究方法將酰胺I帶進行各峰歸屬:1 600～1 625 cm- 1為分子間β-折疊,1 626～1 640 cm-1為分子內β-折疊,1 641～1 650 cm-1為無規則卷曲,1 651～1 660 cm-1為α-螺旋,1 661～1 685 cm- 1為β-轉角,1 686～1 700 cm-1為反向平行β-折疊。根據擬合圖確定各子峰與不同二級結構的對應關系,由其積分面積計算各二級結構的相對含量結果見表3。

表3 SPI替代0～50%牛乳蛋白酸奶二級結構的含量變化

蛋白二級結構主要分為α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲4種結構,其中α-螺旋、β-折疊中含有較多的氫鍵,故是較有序、規則的結構。由表3可知,隨SPI替代量的增加,酸奶中蛋白質二級結構確實發生明顯變化。所有酸奶樣品中的二級結構主要以β-折疊為主,占總含量40%以上,α-螺旋、β-轉角次之,占總含量的20%以上。隨著SPI替代量的增加,β-折疊的含量有下降的趨勢,相應的α-螺旋、β-轉角、無規卷曲不同程度的有所增加,而β-折疊與α-螺旋依舊占比很大,酸奶中二級結構依然是規則有序的。SPI替代10%～50%牛乳蛋白酸奶的總β-折疊含量下降,而α-螺旋、β-轉角增加,說明有序的β-折疊轉化成了有序的α-螺旋與無序的β-轉角,而當替代量增加到50%時,β-折疊、α-螺旋、β-轉角均有一部分轉化成了無序的無規卷曲,這可能是由于加入過多的大豆蛋白造成的,但有序的β-折疊、α-螺旋占比依然最大,因此對酸奶結構體系的影響較小。

3 結論

通過保持原材料中蛋白質總含量不變,用大豆蛋白部分替代牛乳蛋白制備酸奶,酸奶的性質與結構發生了顯著變化。在一定范圍內用SPI替代牛乳蛋白較空白組都能顯著提升酸奶制品持水性及質構特性;滴定酸度降低;pH無明顯變化;色度呈現先變亮后變暗的趨勢;總體而言,SPI的替代對酸奶各方面性質均有積極的影響。掃描電鏡可以觀察到,隨SPI替代量的增大,酸奶中2種蛋白相互交聯形成了堅硬且致密的網絡凝膠;電位與粒徑均增大,表面疏水性呈波動下降趨勢,這可能是發酵過程中大豆蛋白形成大的聚集體,與質構及電鏡觀察的結果也是一致的。在二級結構上,隨著SPI替代量的增加,β-折疊的含量有下降的趨勢,相對的α-螺旋、β-轉角、無規卷曲不同程度的有所增加,這說明酸奶中蛋白質二級結構發生了改變與轉化。