黑果枸杞乳酸菌發酵飲料生產工藝研究

衡洋洋,周志磊,3,陳超,宋亞玲,庫進良,姬中偉,3,毛健,3,5*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)2(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學),江蘇 無錫,214122)3(江南大學(紹興)產業技術研究院,浙江 紹興,312000)4(北京同仁堂健康藥業(青海)有限公司,青海 德令哈,817000)5(國家黃酒工程技術研究中心,浙江 紹興,312000)

黑果枸杞是我國傳統的具有補益功能的名貴中藏藥材,是青海、新疆、甘肅等省的重要經濟作物,是當地農民增收的重要途徑。黑果枸杞富含花青素、原花青素、多糖和微量元素,是花青素含量最高的漿果之一,有“花青素之王”的美譽[1],而花青素是最有效的天然自由基清除劑,易溶于水。此外黑果枸杞還具有一定的保健功能,如:抗氧化、抗疲勞、護肝和提高免疫力等[2-3]。

近年來,隨著全國種植熱潮的興起和人工培育技術的發展,黑果枸杞種植面積和產量逐年增加,但價格逐漸下跌,影響了農民種植的積極性和產業健康發展。造成這一問題的主要原因可能是黑果枸杞加工鏈條短,以果干等初加工產品為主。目前科研人員已經進行了一些深加工的探索,如:開發黑果枸杞口服液、餅干、果酒、果醋和酸奶等[4-5],黑果枸杞深加工產品種類和產量逐漸增加,其中乳酸菌發酵產品受到人們的關注,原因主要是發酵過程產酸,而花青素在pH<4時結構較穩定[6],所以乳酸菌發酵是提高花青素穩定性的有效途徑之一。目前已有黑果枸杞在果蔬飲料[7]中應用的相關報道,其中黑果枸杞主要起到調節色澤的作用,有研究人員制備了黑果枸杞發酵飲料,發酵后花青素含量顯著增加[8]。但是飲料生產涉及灌裝、殺菌和儲藏等環節,過程中氧氣、光照和溫度等因素可能對花青素和原花青素含量造成不利影響。目前這方面未受到研究人員的重視,也未見如何避免黑果枸杞果汁加工及儲藏過程中花青素和原花青素損失的報道。

干酪乳桿菌是多種果蔬的自生菌,具有良好的耐酸性,可在pH 3.5左右生存,被廣泛用于食品發酵[9],其代謝產物(細菌素、生物活性多肽和短鏈脂肪酸等)可起到促進腸道蠕動,提高腸道功能的作用[10],并且發酵產生乳酸,使飲料具有柔和的酸味,提高產品風味品質,是黑果枸杞發酵的理想菌株。在MRS培養基中干酪乳桿菌增長速度快,由于其成本較高,且容易影響飲料風味,不宜用作擴培培養基,所以需要開發以食品原料為基礎的菌種擴培培養基。本研究以黑果枸杞為原料,以干酪乳桿菌為發酵菌株,以減少花青素和原花青素在加工過程中的損失率為主要目標,重點對酶解條件、擴培培養基、發酵條件和殺菌條件進行優化,以期得到花青素和原花青素保留率高,口感好的黑果枸杞乳酸菌發酵飲料生產工藝,為黑果枸杞產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞,北京同仁堂健康藥業(青海)有限公司提供;干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)MYT,江南大學中國高校工業微生物資源和信息中心(RWBL)保藏;NaOH、冰醋酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、Na2SO3、鹽酸、無水乙醇、無水乙酸鈉、丙酮,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;原花青素(色譜純),合肥博美生物科技有限責任公司;4-二甲氨基肉桂醛(色譜純),上海源葉生物科技有限公司,果膠酶(300 000 U/g)、纖維素酶(200 000 U/g)、無水葡萄糖,睢縣優寶嘉食品有限公司;安佳脫脂乳粉,新西蘭恒天然集團。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC型紫外-可見光分光光度儀,上海美譜達儀器有限公司;MAX-190型酶標儀,美國分子儀器公司;Vortex-2型渦流器,美國科學儀器公司;CF16XR-Ⅱ型離心機,日本日立公司;IS-3型pH計,上海康儀儀器有限公司;BS-224S型分析天平,賽多利斯儀器設備制造有限公司;JPBJ-611Y型便攜式溶解氧測定儀,上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 培養基

MRS培養基(g/L):蛋白胨10,牛肉浸粉8,酵母浸粉4,葡萄糖20,K2HPO42,檸檬酸氫二銨2,乙酸鈉5,MgSO40.2,MnSO40.04,吐溫-80 1.0,pH 5.5～5.9,118 ℃滅菌15 min,固體培養基添加瓊脂15。

擴培培養基(g/L):脫脂乳粉30,葡萄糖70,黑果枸杞汁80,調節pH 5.5～5.9,118 ℃滅菌15 min,其中黑果枸杞汁由枸杞干果1∶8(g∶mL)充分復水打漿制得。

1.4 實驗方法

1.4.1 工藝流程

工藝流程如圖1所示。

圖1 黑果枸杞乳酸菌發酵飲料制作流程

操作要點:

前處理:剔除壞果、雜質,選取色澤飽滿、無機械損傷的干枸杞,并清洗,90 ℃熱燙5 s,枸杞和水按照比例浸泡30 min,將浸泡過的枸杞打漿,得枸杞汁。

菌株活化:在無菌環境下,將保藏的菌種接種于MRS固體培養基上活化后,挑取平板上單菌落接種于MRS液體培養基中,37 ℃下培養12 h,傳代2次,直至菌濃度達到108～1010CFU/mL。

菌株擴培:將活化后的菌株以1%(體積分數,下同)的比例接種于擴培培養基中,培養20～24 h,當菌株濃度達到108～109CFU/mL時,將此培養液以3%的比例接種于枸杞汁中進行發酵。

過濾:將發酵液在5 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液,用0.22 μm濾膜過濾。

灌裝:將過濾后的發酵液裝入容器中并封口。

殺菌、冷卻:將灌裝后的發酵液于85 ℃滅菌25 min,取出冷卻至常溫即獲得黑果枸杞乳酸菌發酵飲料。

1.4.2 酶解條件優化

在37 ℃條件下,分別選取果膠酶2 g/L、纖維素酶2 g/L、果膠酶1 g/L+纖維素酶1 g/L,酶解3 h,進行酶的種類優化;選取果膠酶1 g/L+纖維素酶1 g/L,對酶解時間(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h)進行優化,分別考察各因素對黑果枸杞汁中花青素和原花青素含量的影響。

1.4.3 擴培培養基優化

氮源選用脫脂乳粉,碳源選用葡萄糖,生長因子選用黑果枸杞汁(黑果枸杞汁制備方法同1.4節)。在葡萄糖100 g/L+脫脂乳粉(10、30、50、70 g/L),葡萄糖(10、30、50、70、100、120 g/L)+脫脂乳粉100 g/L,葡萄糖100 g/L+脫脂乳粉100 g/L+生長因子(20、40、60、80、100 g/L)的條件下,分別考察各因素對培養基中乳酸菌菌落總數的影響。

1.4.4 發酵工藝優化

在料水比(1∶15、1∶30、1∶50、1∶100)(g∶mL,下同),接種量3%,37 ℃發酵12 h;料水比1∶30,接種量3%,37 ℃發酵(3、7、12、15、24、27 h)的條件下,分別考察各因素對黑果枸杞飲料的總酸、還原糖、花青素、原花青素和感官評分的影響。

1.4.5 殺菌工藝優化

考察不同殺菌條件(75 ℃ 5～40 min、85 ℃ 5～30 min,以每5 min為一個梯度)[11],對花青素保留率、原花青素保留率以及色差(ΔΕ*)的影響。

1.4.6 指標測定

總酸含量測定參照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》;還原糖含量測定參照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》;花青素含量測定采用pH示差法[12];原花青素含量測定采用4-二甲基氨基肉桂醛法[13];色差采用色差計測定[14]。

微生物指標測定參照GB/T 4789.2—2016 《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》、GB/T 4789.3—2016 《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》、GB/T 4789.15—2016 《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》

參考GB/T 7101—2022 《食品安全國家標準 飲料》中感官要求,邀請10名受過專業培訓的感官評價員成立感官品評小組,從色澤、氣味、滋味和組織狀態4個方面對產品進行感官評價,取平均值作為產品的最終得分。感官評價細則如表1所示。

表1 感官評定表

1.5 數據統計

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析,GraphPad 8.0軟件繪圖,每個樣品測3次平行,結果以平均值±標準偏差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝優化

黑果枸杞中約含有20%的果膠、纖維素等大分子物質,可能會影響出汁率和黑果枸杞汁中花青素和原花青素的含量,使用果膠酶和纖維素酶處理可以部分酶解黑果枸杞中的果膠、纖維素、半纖維素和木質素等物質[15-16],不僅有利于促進風味和功能物質的釋放,改善口感[17],還有利于后續的過濾和澄清。

2.1.1 酶種類對花青素和原花青素含量的影響

采用果膠酶和纖維素酶對黑果枸杞進行處理,由圖2可知,酶解3 h后果汁中花青素和原花青素含量均顯著增加,這說明果膠酶和纖維素酶均對功能成分的釋放有顯著的促進作用,且果膠酶和纖維素酶共同酶解的效果優于單酶,2種酶共同酶解后花青素含量179.75 mg/L,較未酶解提高了12.5%,原花青素含量63.86 mg/L,較未酶解提高了18.3%。這說明2種酶共同作用對黑果枸杞中的大分子物質(如果膠和纖維素等)酶解效果更好,有利于花青素和原花青素的溶出[18],所以最終選用果膠酶和纖維素共同酶解黑果枸杞汁。

a-花青素;b-原花青素

2.1.2 酶解時間

選用果膠酶和纖維素酶進行復合酶解實驗,結果如圖3所示,隨著酶解時間的增加,花青素和原花青素含量均顯著增加,酶解3.5 h后,花青素含量達到最大值182.10 mg/L,原花青素含量在酶解3 h后沒有顯著差異(P>0.05),所以最終確定的酶解時間為3.5 h。

a-花青素;b-原花青素

2.2 擴培培養基優化

工業上多用20%～30%的脫脂乳培養基或者降低脫脂乳的含量(3%～5%)加入一定的碳源和生長因子制備成復合培養基,相較之下復合培養基的營養物質含量豐富且成本低。因此本研究以脫脂乳粉為氮源,葡萄糖為碳源,枸杞汁為生長因子,以菌落總數為指標進行優化,以期獲得菌株生長情況好、價格低廉且可以直接應用于黑果枸杞飲料中的菌種擴培培養基。

由圖4可知,隨著氮源、碳源和生長因子添加量的增加,菌落總數呈現先增加后平穩的趨勢,最終確定培養基配方:脫脂乳粉30 g/L、葡萄糖70 g/L、枸杞汁80 g/L,經過實驗驗證,在擴培培養基中生長24 h后,乳酸菌菌落總數為1.8×109CFU/mL,與在MRS培養基中生長24 h后的菌落總數(2.1×109CFU/mL)相當,說明優化后的培養基可以滿足干酪乳桿菌擴培的要求。

a-脫脂乳粉;b-葡萄糖;c-枸杞汁

2.3 發酵工藝優化

2.3.1 料水比

由圖5-a可知隨著水添加量的減少,總酸含量逐漸增加,說明乳酸菌能很好的利用枸杞中的營養物質產酸,但是總酸含量的增加導致pH降低,制約乳酸菌繼續生長。雖然料水比1∶30和1∶15時花青素保留率及原花青素保留率沒有顯著性差異(圖5-b、圖5-c),但是料水比1∶30時酸度適宜(圖5-a),具有較好的口感(圖5-d),因此最終選擇的料水比為1∶30,這與閆世芳等[19]的結果一致,此時花青素保留率為112.48%,原花青素保留率為83.64%。值得注意的是原花青素的損失量基本與花青素的增加量相同,說明有可能在發酵過程中有一部分原花青素降解為花青素,彌補了花青素的損失,所以導致花青素含量增加。

a-總酸;b-花青素;c-原花青素;d-感官評分

2.3.2 發酵時間

由圖6-a可知,隨著發酵時間的增加,總酸含量呈現先增加后不變的趨勢,還原糖含量呈現先降低后不變的趨勢,這可能是由于乳酸菌發酵利用了枸杞中的還原糖,而乳酸的產生會導致pH降低,從而抑制干酪乳桿菌的生長,導致總酸含量不變。如圖6所示發酵過程中花青素含量先平穩后增加,原花青素含量顯著降低,花青素的增加可能是由于發酵過程中的溶出以及原花青素在酸性條件下的分解[20]。在發酵過程中,總酸含量隨時間逐漸增長,經感官評價小組評估,發酵15 h時酸度適宜,口感柔和,感官評分最高(圖6-c),因此選擇了發酵時間為15 h,最終總酸含量3.54 g/L。

a-總酸和還原糖;b-花青素和原花青素保留率;c-感官評分;d-花青素和原花青素含量

2.4 殺菌工藝優化

殺菌是飲料生產過程中的一個重要環節,其工藝參數對產品品質和貨架期都有重要的影響[21]。殺菌時花青素和原花青素的損失程度除了受溫度和時間影響外,還受到光照、氧氣等其他因素的影響,但是這些因素很多時候沒有引起重視,所以本文對殺菌過程中氧氣和光照對花青素和原花青素保留率的影響進行了研究。

2.4.1 溫度和時間

本研究制備的飲料pH<4,為酸性飲料,巴氏殺菌可滿足殺菌要求,由表2可知,75 ℃、30 min及85 ℃、25 min時菌落總數、霉菌和大腸桿菌均未檢出。隨著殺菌溫度和時間的增加,花青素和原花青素的保留率均顯著性降低,說明長時間高溫殺菌對花青素和原花青素的損傷較大,所以在選擇殺菌條件時應盡量選擇較低的殺菌強度。隨著溫度和時間的增加,飲料色差增加,但ΔΕ*>3時,肉眼才可以察覺到差異,即在本研究選擇的殺菌時間范圍內,由殺菌造成的色差影響均可接受。綜合以上結果,最終確定的殺菌參數為85 ℃加熱25 min,此時花青素保留率79.20%,原花青素保留率83.71%。

表2 黑果枸杞飲料不同殺菌條件下的理化指標及微生物指標

2.4.2 光照強度

在優選的殺菌條件下探究光照對飲料中花青素和原花青素保留率及色差的影響,結果如圖7所示,光照強度對原花青素保留率有顯著性影響,對花青素保留率和產品色差沒有顯著性影響。避光殺菌后原花青素保留率提高4.5%,說明光照主要影響飲料中的原花青素含量,對花青素和產品色澤的影響較小,這可能是因為原花青素對光照較敏感[22]。所以最終選擇在殺菌時避光。

a-花青素保留率;b-原花青素保留率;c-色差

2.4.3 氧氣含量

在優選的殺菌條件下探究氧氣含量對飲料中花青素、原花青素和色差的影響,由圖8可知,發酵液中氧氣含量為6.0 mg/L。進行梯度除氧后殺菌,結果表明,氧氣濃度對原花青素保留率和色差沒有顯著性影響,對花青素保留率有顯著影響,氧氣濃度越低,花青素保留率越高,在料液中氧氣含量低于0.5 mg/L時,花青素保留率基本保持不變,此時花青素保留率較不除氧時提高4.8%,說明氧氣含量主要影響飲料中的花青素含量,這可能是因為花青素易受氧氣的影響[23]。所以在殺菌時控制料液中氧氣含量小于0.5 mg/L。

a-原花青素保留率;b-花青素保留率;c-色差

2.5 產品質量評價

2.5.1 感官指標

色澤:紫黑色,色澤均勻,有光澤;滋味和氣味:擁有黑果枸杞獨有的風味和乳酸菌發酵的獨特香氣,酸甜適口,口感細膩;組織形態:產品澄清透明,流動性好,無肉眼可見的雜質和沉淀。

2.5.2 理化指標

黑果枸杞乳酸菌發酵飲料,離心沉淀率0.078%,產品穩定性好。成品總酸含量3.54 g/L,還原糖含量4.73 g/L,花青素含量163.51 mg/L,原花青素含量54.90 mg/L。理化指標符合GB/T 7101—2022《食品安全國家標準 飲料》及GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》等國家標準。

2.5.3 微生物指標

黑果枸杞乳酸菌發酵飲料微生物指標符合GB/T 7101—2022《食品安全國家標準 飲料》及GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》等國家標準,致病菌未檢出。

3 總結與展望

本文主要研究了如何在黑果枸杞乳酸菌發酵飲料加工過程中減少花青素和原花青素的損失,通過對酶解條件、擴培培養基、發酵工藝以及殺菌條件進行優化,得到了黑果枸杞乳酸菌發酵飲料的最優生產工藝。酶解顯著提高了黑果枸杞汁中的花青素和原花青素含量,發酵顯著提高了花青素的含量和穩定性,但是殺菌會造成花青素和原花青素的大量損失,通過優化殺菌參數和控制環境因子,可以有效減少花青素和原花青素在殺菌過程中的損失。本研究利用干酪乳桿菌發酵制備的黑果枸杞飲料不僅口感柔和、風味優良,花青素和原花青素的保留率也得到了明顯的提高,后續將繼續研究黑果枸杞乳酸菌發酵飲料儲藏過程中主要功能成分的含量變化及其保護技術。