不同芥菜變種發酵過程中品質因子及硫代葡萄糖苷代謝產物差異分析

梅源,劉獨臣,賴海梅,黃玉立,王雅利,葛黎紅,曾雪晴,楊夢露,朱永清,趙楠*

1(四川省農業科學院農產品加工研究所,四川 成都,610011)2(四川省農業科學院園藝研究所/蔬菜品種改良與種質創新四川省重點實驗室,四川 成都,610066)3(四川師范大學 生命科學學院,四川 成都,610101)

泡菜加工作為一種傳統蔬菜深加工方式,在延長蔬菜產業鏈、增加蔬菜產品附加值方面具有重要作用[1]。然而,泡菜行業目前同質化競爭嚴重,難以突出產品特色。因此,根據不同需求使用不同品種蔬菜原料進行發酵,從而突出泡菜的特色風味和豐富的益生功能性尤為重要。芥菜(BrassicajunceaCoss)是十字花科,蕓薹屬一年生或兩年生草本植物,栽培面積廣,是中國重要的農業經濟作物[2]。相比其他區域,四川地區芥菜的分化程度最高,變種和品種數量最多,共分為根、莖、葉、薹等16個變種[3]。除了常用于鮮食外,芥菜的發酵加工也十分盛行,如生產中常用葉用芥菜中的寬柄芥發酵制作酸菜,莖用芥菜中的莖瘤芥用來發酵生產榨菜。另外,各類芥菜均可用于家庭泡菜的制作,是四川泡菜原料中重要的組成部分。

芥菜具有豐富的營養物質,如抗壞血酸、β-胡蘿卜素、多酚類化合物以及鉀、鈣、鐵等礦物質[4],除此之外還富含一類重要的次生代謝產物——硫代葡萄糖苷(glucosinolates,GSL)。GSL性質較穩定,難以被人體直接吸收利用,經酶解或微生物代謝轉化后產生異硫氰酸鹽、硫氰酸酯和腈類等水解產物,并產生特有的風味[5-6]。其中異硫氰酸酯類物質是重要的生物活性物質,具有抑菌、抗氧化、抗癌、緩解肥胖等功效[7-8]。基于不同的芥菜品種,前人針對其不同采后品質性狀、GSL組成與含量差異、發酵加工感官風味差異等方面已有一定研究[9-11]。但在不同芥菜變種的發酵加工方面,由于其硫苷種類和含量不同,水解產物的功能特性對發酵過程的影響結果尚不明確,且基于硫苷代謝產物來評估不同芥菜變種的發酵加工性差異相關的研究尚未見報道。

本研究使用6種不同變種芥菜進行發酵,對發酵初始和發酵終止期樣品的微生物數量、理化指標、有機酸含量以及揮發性化合物中的硫苷代謝產物進行測定,并且通過相關性分析不同變種芥菜發酵差異性,進而評估不同芥菜變種的發酵加工特性差異,以期為篩選具有更好發酵加工特性的芥菜品種與變種提供一定的科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基于前期對16個芥菜變種發酵預實驗及芥菜變種發酵后嗅聞感官評價的差異化結果,本實驗采用6個不同芥菜變種為原材料,分為葉芥和莖芥兩大類,均由四川省農業科學院園藝所提供(圖1),所有材料統一種植于四川省成都市新都區四川省農業科學院新都試驗基地。泡菜鹽、礦泉水,成都生鮮超市;MRS培養基、孟加拉紅培養基,青島海博生物技術有限公司;對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaNO2、NaOH標液,成都科隆試劑有限公司;乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硼砂,成都金山試劑有限公司,所有試劑均為分析純。

a-葉芥類-長柄芥;b-葉芥類-鳳尾芥;c-葉芥類-寬柄芥;d-莖芥類-筍子芥;e-莖芥類-抱子芥;f-莖芥類-莖瘤芥

1.2 儀器與設備

Synergy HTX多功能型酶標儀,美國Bio Tek有限公司;Intuvo9000-GC System-5977b氣質聯用色譜儀、1260液相色譜儀,美國Agilent公司;JA5003型電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司;Seven Compact S210型pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SPME萃取纖維,50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡芥菜準備

將6個不同變種的芥菜洗凈,切除根部。為了芥菜整體發酵均勻,將可食用部位攪打為勻漿。準備鹽度6%(質量分數,下同)的發酵鹽水18瓶,各500 mL,將芥菜勻漿與發酵鹽水混合置于絲口瓶中密封,25 ℃恒溫發酵30 d,蔬菜與鹽水的質量比為1∶2,使最終發酵混合體系的鹽度在4%左右。在發酵0和30 d取樣,每次取3瓶樣品作為重復,微生物指標于取樣當天測定,剩余樣品存放于-80 ℃冰箱中進行后續指標的測定。

1.3.2 微生物計數

于無菌條件下取不同芥菜變種發酵樣品50 g于均質袋中,加入450 g無菌生理鹽水進行均質,梯度稀釋后進行微生物計數。參考GB 4789.2—2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行細菌總數的測定;參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》進行酵母菌數的測定。

1.3.3 理化指標檢測

取5.0 g不同發酵時間和不同變種的泡芥菜樣品加入45 mL蒸餾水,采用pH計測定樣品pH值。泡芥菜前處理參考ZHAO等[12]的方法進行,前處理后取上清液進行理化指標的測定。樣品可滴定酸含量采用酸堿中和滴定法進行測定[13];還原糖含量采用二硝基水楊酸法測定[14];參考GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法測定樣品中亞硝酸鹽。

1.3.4 有機酸測定

樣品前處理參考ZHAO等[12]的方法,樣品提取液通過離心機10 000 r/min常溫離心10 min后,上清液通過0.22 μm濾膜過濾,用于后續進行HPLC分析。采用美國Bio-Rad有機酸分析柱(Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm)分離有機酸,柱溫35 ℃,進樣量5 μL,流速0.6 mL/min,檢測波長為215 nm。流動相為0.004 mol/L H2SO4溶液,檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸均以相應標準品作為定量外標。

1.3.5 硫苷代謝產物測定

由于硫苷類代謝物的揮發性較強,主要使用頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯用技術(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)進行指標測定。取不同發酵時間和不同變種的泡芥菜樣品5.0 g置于20 mL的頂空進樣瓶中用于GC-MS分析,GC-MS條件設定參考文獻[15],測定結果經NIST17.L譜庫檢索,其中匹配度大于750的物質進一步進行定性分析,從檢測出的所有揮發性物質中找出所有硫苷代謝物,以面積歸一化法計算其相對含量。

1.4 數據處理與統計分析

采用SPSS 26.0對數據進行方差分析、多重比較(Duncan分析法,P<0.05);主成分分析(principal component analysis,PCA)以及偏最小二乘回歸分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)采用SIMCA 14.1,柱狀圖及相關性分析熱圖均使用Origin 2021繪制。

2 結果與分析

2.1 不同芥菜變種發酵微生物含量差異分析

為明確不同芥菜變種在發酵中微生物的含量差異,對發酵0和30 d不同樣品中的細菌和酵母菌進行計數。初始微生物計數方面,6個變種的酵母菌數量均高于細菌(表1)。隨著發酵的進行,不同樣品中細菌含量增加,酵母菌含量除J2樣品外均低于發酵0 d,與前人研究一致[16-17]。其中,細菌的增加量為1.22～3.5 lg CFU/g,酵母菌的減少量也在1.8～4.6 lg CFU/g,葉芥中Y1的細菌增長量最高,莖芥中J1的細菌增長量最高,但其酵母菌含量在發酵30 d時幾乎沒有差異。J3在發酵終止時細菌含量最高,達到4.11 lg CFU/g。以上結果表明不同變種芥菜間發酵程度具有較大差異。這可能是由于不同變種芥菜中含有的硫苷及其代謝物、植物組織結構和內生初始微生物等的差異限制了Y3、J2樣品在發酵過程中微生物的生長代謝[18-19]。

表1 不同芥菜變種發酵0 d和30 d微生物計數差異 單位:lg CFU/g

2.2 不同芥菜變種發酵理化指標差異分析

泡菜的理化指標可以反映發酵體系中微生物的生長情況,也與泡菜的感官風味品質密切相關[20]。不同芥菜變種在發酵0和30 d時基本理化指標的差異結果如表2所示,各個樣品在不同發酵時間下pH、總酸和還原糖含量均呈現顯著差異。在發酵0 d時,葉芥類樣品的pH值均低于莖芥,總酸含量均顯著高于莖芥類樣品。但在發酵30 d 時,pH值和總酸含量體現出不同樣品發酵的差異。有研究表明,泡菜總酸含量在0.6～0.8 g/100 g時酸味感官能達到最佳水平[21]。6個樣品中僅有Y3、J1和J2三個樣品總酸含量在0.6 g/100 g以上,J3樣品在發酵過程中總酸含量增加了0.15 g/100 g,而Y1和Y2樣品在30 d的發酵中pH值雖然略有上升,但總酸含量幾乎沒有變化。

表2 不同芥菜變種發酵0 d和30 d理化指標的差異

還原糖含量的變化與總酸的變化趨勢相反,Y3、J1和J2樣品中還原糖至少降低了0.3 g/100 g,說明在這些樣品中微生物能有效地將糖轉化為酸。雖然在表1中Y3和J2發酵30 d時細菌含量均未達到2 lg CFU/g以上,但其發酵程度表明其中主要微生物可能是乳酸菌。在其他3個樣品中,Y1發酵30 d時還原糖含量甚至略有增加,這可能是由于微生物未能較好消耗糖類物質,且長時間的發酵使蔬菜中糖類物質更多溶出導致。雖然J3發酵30 d時細菌含量最高,但其pH值、還原糖和總酸的變化量較低,可能是由于發酵樣品中微生物的組成結構不同且乳酸菌含量較低導致。亞硝酸鹽含量除了J3樣品在發酵30 d后有顯著降低外,其他樣品不同發酵時間和不同樣品間沒有顯著差異,且含量均遠低于國家規定的20 mg/kg。

2.3 不同芥菜變種發酵有機酸含量差異分析

有機酸是蔬菜進行微生物發酵過程中的重要代謝產物[11, 20],不同芥菜變種在發酵0 d和30 d時有機酸的含量和組成具有較大差異(表3)。

表3 不同芥菜變種發酵0 d和30 d有機酸含量差異 單位:g/kg

總體而言,發酵0 d時葉芥類樣品檸檬酸含量均高于莖芥類樣品,而琥珀酸和乙酸的含量均低于3個莖芥類樣品。但在發酵30 d后,除了乳酸含量均有所增加,其他有機酸的變化趨勢各不相同。芥菜中含量最高的有機酸為琥珀酸,J3樣品在發酵第0天和30天時含量最高,分別是17.56和25.19 g/kg;Y1、J1和J2樣品乳酸增加量較多,分別增加了4.25、6.69和6.74 g/kg,乳酸增加量與總酸含量的變化體現出的結果一致。有學者[22-23]的研究表明,蔬菜在自然發酵過程中乳酸逐漸積累,其他有機酸如乙酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸等均逐漸降低甚至不能檢出,說明乳酸發酵是泡菜的主要發酵模式,并且在長時間的發酵過程中有機酸的多樣性會逐漸降低[12]。結合6個芥菜變種中有機酸的變化趨勢,發現Y3、J1和J2樣品在乳酸增加的同時,其他有機酸含量均有所降低,表明以上3種芥菜主要進行乳酸發酵。與之相反的是Y1、Y2和J3樣品,盡管乳酸含量略有增加,但其檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和乙酸含量也有所增加。自然發酵條件下,Y1和J3樣品琥珀酸含量分別增加了18.5%和43.5%,Y2樣品和J3樣品乙酸含量分別增加了45.1%和38.3%,以上結果表明這3個樣品中占據主導的并非乳酸發酵,這可能是由于乳酸菌的生長在這些樣品中因不同硫苷代謝產生的抑菌物質而受到抑制。

2.4 不同芥菜變種發酵硫苷代謝物差異分析

2.4.1 揮發性風味物質PCA

揮發性風味物質的組成和含量極大影響了泡菜的風味感官品質[23]。尤其對于芥菜而言,硫苷水解代謝出的異硫氰酸酯類、硫氰酸酯以及腈類物質是揮發性物質中的重要組成部分[24]。為了明確不同芥菜變種在不同發酵時期揮發性化合物的整體概況以及所鑒定出的化合物是否具有代表性,以不同物質的相對含量為X變量,不同變種樣本為Y變量,分別對發酵0 d和30 d樣品進行無監督的PCA。由圖2-a可知,不同樣品在發酵0 d時揮發性風味物質的組成上具有較好的區分度,說明不同樣品在發酵初期揮發性物質的差異較大。其中3個葉芥在PCA得分圖中顯著區分開,Y1和Y3與第一主成分呈正相關,與第二主成分呈負相關;Y2與第一主成分呈負相關,與第二主成分呈正相關,說明3個葉芥樣品間揮發性成分存在較大種間差異。在莖芥類樣品中,J2樣品與J3和J1樣品存在顯著差異,J3和J1樣品則在揮發性風味物質的特征上較為接近。

a-發酵0 d;b-發酵30 d

隨著發酵的進行,不同樣品的揮發性風味物質特征產生了較大的變化(圖2-b)。發酵30 d時,3個葉芥類樣品揮發性成分特征趨于一致,均位于PCA得分圖的第二象限。但在莖芥類樣品中,僅J1和J2樣品風味輪廓較為接近,且與J3樣品明顯區分開。這一結果表明,盡管3個葉芥在乳酸發酵進程和有機酸組成上存在差異,但揮發性成分還是會隨著發酵時間的增加逐漸趨向歸一化[23]。然而,在莖芥樣品中J3樣品發酵0 d時與J1相似,但在發酵30 d后在微生物含量和有機酸組成的巨大差異下,其揮發性風味物質輪廓與J1和J2樣品存在顯著差異,這表明J3發酵終止時風味輪廓的不同主要不是原料差異所導致,而與發酵進程有關。

2.4.2 硫苷代謝物差異分析

為了明確不同芥菜變種中具有主要差異的硫苷代謝化合物,對發酵0 d和30 d下各芥菜樣品的揮發性風味物質進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),分別在發酵0 d和30 d模型中鑒定出12種和14種VIP>1.0的差異貢獻化合物(電子增強出版附圖1、圖2、表1和表2,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033629),其中有6種異硫氰酸酯類化合物和2種腈類化合物,具體相對含量變化如圖3所示。比較發酵0 d和發酵30 d之間的硫苷代謝產物發現,發酵顯著降低了主要異硫氰酸酯類物質的含量,包括異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、異硫氰酸環丙酯和3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯,僅有異硫氰酸仲丁酯在3個葉芥樣品中顯著增加,在J2和J3樣品中顯著降低。腈類物質在各芥菜變種中差異較大,2-丁烯腈在Y3和J1樣品中顯著增加,其他樣品顯著降低或未檢出;而烯丙基腈變化趨勢與2-丁烯腈相反,尤其是J2和J3樣品烯丙基腈增加量較高。

a-異硫氰酸烯丙酯;b-3-丁烯基異硫氰酸酯;c-2-苯基乙基異硫代氰酸酯;d-異硫氰酸環丙酯;e-異硫氰酸仲丁酯;f-3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯;g-2-丁烯腈;h-烯丙基腈

異硫氰酸酯類物質是芥菜中硫苷代謝出的獨特風味物質,主要貢獻了辛辣、刺激和辣根類氣味[25]。本實驗中,異硫氰酸烯丙酯相對含量最高,在不同變種的新鮮芥菜樣品中均值達到70%以上,隨后其含量逐漸降低,與前人的結果一致[16,22,26]。有研究表明,由于芥子酶催化水解后硫代葡萄糖苷不穩定中間體的重排與側鏈和水解條件密切相關,在pH為5～8時,硫代葡萄糖苷的主要降解產物為異硫氰酸酯,pH為2～4時形成腈類物質[22]。本試驗中發酵0 d時異硫氰酸酯類物質含量最高與此結論一致,但在發酵30 d時腈類物質的生成規律不同,這可能是由于其前體物質GSL在發酵前期水解程度較高所致。除了環境因素,發酵體系微生物對GSL的水解代謝也有影響,不同微生物對GSL的代謝能力不同。研究表明[18, 27]一些乳酸菌、乳球菌和雙歧桿菌均能有效代謝GSL,但大部分代謝產物是具有一定安全風險的腈類物質;而一些片球菌屬微生物能代謝產生具有功能活性的異硫氰酸酯類物質。本實驗中硫苷代謝物變化差異性最大的芥菜是J3樣品,在發酵30 d時其中6種異硫氰酸酯類化合物包括含量最高的異硫氰酸烯丙酯均降低至未檢出,而烯丙基腈相對含量從0%增加至50%左右,是J2的增加量的2.28倍,Y2增加量的18.68倍。結合表1微生物的結果推測可能是J3樣品中微生物的組成與其他樣品不同導致的,該結果也與圖1中顯示的一致。另外,進行較好乳酸發酵的Y3、J1和J2樣品在硫苷代謝產物的變化規律上與大多數傳統蔬菜發酵的變化規律一致[22, 24]。以上結果表明,不同變種硫苷組成差異與其微生物代謝緊密相關,且對蔬菜的發酵進程和發酵品質具有極大的影響。

2.5 不同芥菜變種發酵相關指標與硫苷代謝物相關性分析

為了進一步研究硫苷代謝產物與其他發酵指標的相關性,對微生物指標、理化品質指標和幾種硫苷代謝差異化合物進行了Pearson相關分析(圖4),異硫氰酸酯類化合物和腈類化合物與芥菜發酵的其他品質指標之間均有一定相關性。含量最高的異硫氰酸烯丙酯與發酵芥菜中的細菌、總酸和琥珀酸含量呈顯著負相關,與酵母菌和pH值呈正相關。異硫氰酸仲丁酯與發酵芥菜中的酵母菌、蘋果酸、琥珀酸和乙酸含量呈顯著負相關。在腈類物質方面,2-丁烯腈和與烯丙基腈均與發酵樣品中的細菌均呈顯著正相關。其中2-丁烯腈與芥菜中乳酸含量呈顯著正相關,而烯丙基腈與琥珀酸呈顯著負相關。MULLANEY等[27]通過對比腸桿菌科、植物乳桿菌和乳酸乳球菌發酵西藍花提取物,發現不同微生物代謝硫苷類物質產生的水解代謝產物具有較大差異,表明不同微生物種屬對硫苷代謝產物具有較大影響。因此,在細菌和酵母菌對這些硫苷代謝物的相關分析結果中,需要進一步討論不同芥菜變種發酵體系中微生物組成的差異。目前已有部分研究針對發酵蔬菜中的乳酸菌[18]、人體腸道中的多形擬桿菌[28]等細菌對GSL的代謝相關研究,對酵母菌等對硫苷代謝相關的研究較少。相關性分析結果表明,酵母菌可能通過一些協同作用從而間接影響GSL在發酵過程中的代謝過程,從而影響最終代謝產物。總的來說,GSL在發酵芥菜中代謝產生不同的水解產物,其生理功能或毒性均能影響發酵蔬菜的品質,這些指標在評估蔬菜發酵程度和最終泡菜品質方面具有重要作用,也可對未來泡菜專用品種的選育提供輔助參考。

圖4 不同芥菜變種發酵相關指標與硫苷代謝物相關性熱圖

3 結論

本研究對6個不同芥菜變種進行自然發酵,并對發酵前后的泡菜品質指標和硫苷代謝產物進行了對比分析,不同變種芥菜在發酵前后微生物、pH值、總酸、還原糖、有機酸和揮發性風味物質含量均表現出顯著差異。寬柄芥(Y3)、筍子芥(J1)和抱子芥(J2)發酵樣品pH值均在4以下,總酸含量均高于0.6 g/100 g,乳酸增加量在4.25 g/kg以上,以上芥菜樣品主要進行乳酸發酵且發酵狀況良好。長柄芥(Y1)、鳳尾芥(Y2)和莖瘤芥(J3)的pH值和總酸含量沒有顯著變化,發酵結束時產生大量的琥珀酸而乳酸增加量較小,未進行有效的乳酸發酵。此外,本研究進一步分析了不同樣品中主要差異性硫苷代謝產物的變化規律,并和發酵相關指標進行了相關性分析。結果表明,不同樣品中含有的異硫氰酸酯和腈類物質的含量和種類各有差異,其中的主要揮發性化合物為異硫氰酸烯丙酯,其含量隨發酵逐漸降低;發酵程度最低的莖瘤芥產生的烯丙基腈含量最高。細菌和酵母菌與硫苷代謝產物均有顯著相關性,但需進一步分析發酵體系中不同微生物組成和菌株差異對硫苷類物質代謝的影響。實驗結果為芥菜發酵品質評價和發酵專用芥菜變種與品種篩選提供了一定的理論基礎。