鐵棍山藥多糖對產后腰痛運動康復的抗氧化與抗疲勞影響研究

馮斌,楊琦,曹佳

1(北京科技大學 天津學院,天津,301830)2(河北大學附屬醫院,河北 保定,071000)3(天津生物工程職業技術學院,天津,300462)

隨著生物實驗科技的更新迭代以及對于人體生理健康研究的不斷深入,對于人體運動后疲勞狀態下自由基生物學的探索受到來自于多個學科領域科研人員的普遍重視。目前對于運動康復實踐尤其在生理機能提升的恢復訓練階段,通常以有氧耐力性運動作為主要手段[1-2]。由此分析,產后腰痛患者在運動康復過程當中,承受來自于病理部位生理機能恢復機制、運動行為超量恢復機制的雙方面影響,雖不比針對某一肌群的大運動強度刺激所形成運動疲勞的生理變化明顯,但產后腰痛患者通過以人體核心區域為協調的較長時間有氧運動,消耗更多的人體儲備能量大幅提升每分攝氧量,是其運動生理代謝水平增長的重要體現,也是造成運動疲勞積累的另外一種表現,并且會在體內產生大量活性氧自由基,造成脫氧核糖核酸主鏈斷裂、細胞發生異變、病變等,極易造成產后腰痛患者的二次損傷[3-4]。

鐵棍山藥(DioscoreaoppositaThunb.cv.Tiegun)為薯蕷科薯蕷屬植物,其塊莖使用方式通常分為食用和藥用兩種,其在中國產地集中于河南省焦作市溫縣、沁陽市、武陟縣等地,中醫學中對于鐵棍山藥的功效表述為健脾養胃、滋腎養肺等。鐵棍山藥包含了多糖、皂苷、多酚氧化酶、自由氨基酸等豐富的生物活性物質以及多種微量元素,對于人體能夠起到良好的降低血糖血脂、提升免疫能力、調節激素代謝紊亂、促進組織器官生理損傷的機能康復與提升等作用,而鐵棍山藥富含的多糖物質被視為構成的主要活性成分,其作用價值在藥學領域以及營養補充領域當中備受關注[5]。

鐵棍山藥的多糖提取通常選用水提醇沉法[6],產生了微波、纖維素酶等多糖提取方法。鐵棍山藥的多糖結構較為復雜,其生物活性與結構呈線性關系,因此提取方法的差異會造成多糖得率、提取成分、生物活性等直觀的結果影響。目前對于鐵棍山藥多糖提取,以及鐵棍山藥作為營養補充干預運動后抗氧化和疲勞恢復相關研究成果較少,客觀限制了鐵棍山藥多糖活性的應用與推廣[7]。本研究以鐵棍山藥作為研究對象,通過水提醇沉法、微波輔助提取法、纖維素酶法、微波-酶法分別進行鐵棍山藥的多糖提取,并且對不同提取結果進行體外抗氧化性能測試,將不同方法提取結果配制飲品作為受試對象運動康復訓練的補充劑,通過雙盲試驗方法,受試者于訓練后及次日晨通過血液指標的采集,實現對鐵棍山藥抗氧化及抗運動疲勞的科學驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥,購于河南省焦作市溫縣;羥自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒、丙二醛測試盒、超氧化物歧化酶測試盒,上海酶聯生物科技有限公司;無水乙醇、葡萄糖等均為分析純、DPPH、纖維素酶、α-淀粉酶,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

勻漿機,上海歐河設備有限公司;電子天平,天津市德安特傳感技術有限公司;水浴鍋、干燥箱,常州億通分析儀器有限公司;722S分光光度儀,上海棱光技術有限公司;MAS-II Plus常壓微波反應工作站(滿足微波提取實驗功率與溫度的即刻監控與調節),上海新儀微波化學科技有限公司;Pilot2-4LD冷凍干燥機,天津中斯立孚生物技術有限公司;H1850離心機,深圳三莉科技有限公司;RE-52A旋轉蒸發器,鄭州華辰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鐵棍山藥多糖提取及處理方法

篩選出外形完整的鐵棍山藥進行表面清水處理后去除外皮,以2 mm為標準進行切片,避免因實驗周期問題導致實驗樣本發生褐變,使用1 g/L檸檬酸以及0.2 g/L維生素C溶液對切片護色30 min,然后冷凍并且研磨粉碎后過80目篩備用。

(1)水提醇沉法[6]:按照料液比1∶9 (g∶mL)進行混合,80 ℃恒溫水浴靜置240 min,8 000 r/min離心15 min,去除上清液。所獲得的沉淀物經過旋轉蒸發儀濃縮,依據1∶5(體積比,下同)的配比融入80%乙醇同時進行24 h的醇沉,最后以離心方式獲取沉淀部分并且完成干燥處理,即可得到山藥多糖。(2)微波輔助提取法[8]:將微波儀器設置功率為650 W,60 min,實驗料液比為1∶12 (g∶mL);80 ℃恒溫水浴240 min后,8 000 r/min離心15 min,以1∶5比例加入80%乙醇后靜置24 h,通過離心方式進行沉淀提取與干燥。(3)微波-酶劑協同提取法[9]:實驗料液比設定為1∶6(g∶mL)、微波儀器功率830 W、150 min,酶添加量為0.5 g淀粉酶、0.05 g纖維素酶(50 g山藥粉末),85 ℃恒溫水浴過程當中進行緩慢攪動加快溶解速度,8 000 r/min離心15 min,以1∶5比例加入80%乙醇后靜置24 h,通過離心方式進行沉淀提取與干燥。(4)纖維素酶提取法[10]:酶添加量為3%、酶解時間設置為75 min、酶解溫度設置60 ℃、料液比1∶30(g∶mL)、0.05 g纖維素(50 g山藥粉末),恒溫水浴過程當中進行緩慢攪動加快溶解速度,8 000 r/min離心15 min后以1∶5比例加入80%乙醇后靜置24 h,通過離心方式進行沉淀提取與干燥。

以水提醇沉法為例,鐵棍山藥進行多糖提取得率的計算方式如公式(1)所示:

山藥多糖得率/%=ρ×V/(m×10)×100

(1)

式中:ρ,提取結果當中多糖的質量濃度,μg/mL;V,提取結果的體積,mL;m,鐵棍山藥粉添加的質量,g。

1.3.2 鐵棍山藥多糖提取濃度的測定

使用苯酚-硫酸法測定研究當中所采用的不同方法提取后鐵棍山藥多糖含量[11]。添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液,用蒸餾水定容至2 mL,不添加葡萄糖的對照管用于對照調零。在490 nm處測定各管的吸光值,以葡萄糖質量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線為y=10.616x-0.021,R2=0.997。

1.3.3 鐵棍山藥多糖的抗氧化能力

經過4種提取方式進行鐵棍山藥多糖的提取后,依據提取順序進行體外DPPH自由基、·OH的清除能力檢測[12-13],記錄鐵棍山藥不同提取方法及不同濃度多糖對體外抗氧化能力結果的數據[14-15]。

1.3.4 運動后氧自由基消除及抗疲勞能力

以水提醇沉法、微波輔助提取法、微波-酶劑協同提取法、纖維素酶提取法完成鐵棍山藥多糖提取,配制營養補充劑并且依次劃分試驗組,共分為試驗組A、B、C、D組、對照組1組,每組人數12人,共60人,產后腰痛患者受試者統計年齡為(30±1.26)歲。通過雙盲試驗研究,在進行封閉式運動康復28 d過程中,參照GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》并且依據試驗不同提取方法配制劑量為200 mg/kg體重的鐵棍山藥提取液,對受試者進行不間斷康復訓練后補充,對照組康復訓練后以同體積的水替代。在每日膳食搭配當中排除番茄、胡蘿卜、山竹等目前研究成果顯示抗氧化能力較強食物,并且除鐵棍山藥補充劑外不再進行其他營養劑攝入。

所有測試組在周期內運動康復皆采取有氧耐力性運動作為訓練手段,受試者、測試人員與教練員對于每日練后營養補充劑成分皆不清楚。由于運動康復整體周期變化也是受試人員身體機能恢復到提高的過程,因此在產后腰痛患者運動康復周期內,前期訓練會導致體能供能物質的過量消耗,對于受試者抗氧化能力與抗疲勞能力的測試會存在顯著誤差,所以對于抗氧化與抗疲勞監控安排在康復周期最后一周的周二、周五,進行10 km/h的50 min勻速耐力跑訓練,于康復訓練的當日清晨、次日清晨以及訓練后第2天清晨對所有受試人員進行空腹狀態下血清睪酮和血清肌酸激酶數據采集,在最后一日的康復訓練前、后即刻采集靜脈血進行血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試。

2 結果與分析

2.1 四種提取方法鐵棍山藥多糖得率統計

運用4種不同工藝對山藥多糖進行提取,重復3次并計算平均數值,對鐵棍山藥多糖得率如表1所示。以水提醇沉法為參照,微波輔助提取法、纖維素酶法、微波-酶法的多糖得率均顯著提高,并且節約了提取時間,這也說明在鐵棍山藥的多糖提取過程中對于細胞壁的破壞是影響多糖得率的重要影響因素。

表1 不同提取方法對鐵棍山藥多糖得率的影響

鐵棍山藥的多糖物質多存儲于細胞內部,而鐵棍山藥細胞壁為纖維素、果膠等物質構成,因此能夠采用添加單一的酶制劑,例如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等,或以添加復合酶等制劑均能達到提升鐵棍山藥細胞壁裂解的功效[6,16],進而促進提取過程當中多糖的釋放。鐵棍山藥通過采用微波-酶劑協同提取法所獲得多糖得率為13.83%,在各提取方法中得率最高的,相對于水提醇沉法所獲得多糖得率提升了83.42%,且反應用時縮短90 min。此外微波輔助提取法(9.30%)與纖維素酶提取法(11.55%)相比較而言,后者鐵棍山藥多糖得率較高,這表明在反應過程中酶劑對于鐵棍山藥細胞壁裂解的效果優于機械式破壁。

與水提醇沉法相比,微波輔助法的鐵棍山藥多糖得率僅小幅提升,也表明微波作用在一定程度上也可能會造成鐵棍山藥多糖降解,從而破壞多糖結構,客觀的導致鐵棍山藥多糖的生物活性降低。

2.2 鐵棍山藥多糖提取雜質去除方法

鐵棍山藥多糖提取物中主要雜質為蛋白類及酚類,為避免因雜質產生的誤差,提取后采用Sevag法去除蛋白類雜質[17],在完成8次除雜操作之后,利用紫外光譜掃描提取物,波長260和280 nm處無吸收峰,則說明蛋白類雜質已被清除。使用Folin-Ciocalteu試劑檢測酚類物質殘留[18-19],呈陰性則說明提取物中無酚類雜質。

2.3 鐵棍山藥多糖體外抗氧化活性比較

2.3.1 鐵棍山藥多糖清除DPPH自由基的能力

如圖1所示,對DPPH自由基清除能力的量效關系相關性較好,隨著多糖濃度的提升清除活性增強。多糖質量濃度2 mg/mL時,水提醇沉法的體外DPPH自由基的清除率為69.32%,微波輔助法的清除率為83.11%,微波-酶法及纖維素酶法清除統計結果分別為94.51%和88.21%。將多糖質量濃度調至3 mg/mL時,纖維素酶、微波輔助酶2種提取方法的DPPH自由基清除率都超過了92%。

圖1 不同提取方法鐵棍山藥多糖的DPPH自由基清除能力

2.3.2 鐵棍山藥多糖清除·OH的能力

山藥多糖分子末端的半縮醛羥基能還原自由基。如圖2所示,微波-酶協同法提取多糖的·OH清除能力最突出,而水提醇沉法提取的多糖效果最差。多糖質量濃度2 mg/mL時,水提醇沉法提取多糖的·OH清除能力為65.01%,微波輔助提取法為75.04%,微波-酶提取法及纖維素酶提取法為88.56%和87.83%,不同濃度下2組差異不明顯。多糖質量濃度3 mg/mL時,纖維素酶提取法以及微波-酶提取法多糖對·OH的清除能力均超過95%。

圖2 不同提取方法所得鐵棍山藥多糖的·OH清除能力

2.4 鐵棍山藥多糖的抗疲勞比較

如表2所示,有氧耐力運動對產后腰痛受試人員的MDA下降水平影響較大,4組試驗受試者訓練后即刻完成血清MDA值采集,相比安靜狀態時MDA下降非常顯著(P<0.01),對照組運動后血清MDA值與安靜狀態時同樣呈現出下降趨勢,具有顯著差異(P<0.05)。而訓練后即刻采集血清的SOD值均呈明顯上升趨勢,并且具有極顯著差異(P<0.01)。

表2 運前后不同組血清MDA、SOD變化

所有試驗組的受試者在2次單周長時間亞極量康復運動后,次日晨采集血清肌酸激酶的增長幅度皆比較明顯,康復訓練后第二日晨的測試結果也呈繼續下降的趨勢,在第二次康復運動前基本恢復到基礎值,如圖3所示,試驗組C、D兩次恢復速度非常顯著,分別為53.07%、51.82%和55.78%、49.75%,但2組受試人員血清肌酸激酶恢復速度差異并不明顯。對照組血清肌酸激酶恢復速度相對較慢,次日晨恢復速度分別為28.26%和28.61%。

圖3 不同試驗組康復訓練晨間血清肌酸激酶變化情況

如圖4所示,在單周2次長時間亞極量康復運動后,次日晨采集血清睪酮下降幅度皆比較明顯,在訓練結束后第二日晨間4個試驗組上升幅度均較大,第2次康復運動前血清睪酮采集結果顯示,4個試驗組不僅恢復到正常值,并且表現出不同超量恢復現象,恢復速度分別為62.27%、57.39%、65.88%、63.23%,兩次測量結果組間差異不顯著。對照組血清睪酮恢復速度較慢,并且在第2次康復運動前沒有表現出超量恢復現象,仍然處于恢復期。

3 討論

在日常生活當中,人體內環境能夠滿足氧自由基動態平衡,并且在正常范圍內能夠實現生理免疫功能以及體內信號傳遞功能等。目前對于動物及人體的氧自由基運動變化研究多集中于單次高強度活動后即刻水平,生物體的清除能力很難繼續維持體內氧自由基的穩定狀態。從生理學研究角度分析,骨骼肌的運動主要依靠肌細胞內K+、Na+、Ca2+的流動,隨著運動時間的延長,人體抗氧化能力減弱,細胞蛋白質多肽鏈斷裂,發生結構變化,堿基喪失,形成細胞畸變,此外骨骼肌細胞膜的磷脂雙分子層結構會與氧自由基發生過氧化反應,使細胞膜通透性發生改變,細胞膜內外電位失衡大量Ca2+堆積,從而抑制細胞進行ATP合成,最終肌纖維失去控制能力,形成炎癥變化以及痙攣狀態,導致運動損傷與疼痛加劇[20-21]。

鐵棍山藥多糖的主鏈主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖構成[6],對于氧自由基的清除作用主要是通過羥基提供的H+[22-23],結合體內游離的·OH消除;此外鐵棍山藥多糖中不同單糖、糖苷鍵、構型會對人體DPPH自由基清除能力有一定影響,但清除能力均較強[5],并且有效激活、快速提升SOD的活性,降低脂質過氧化物MDA、總膽固醇等的整體水平[24],以此實現對細胞內氧自由基數量的控制,加快人體對運動后抗氧化應激的反應時間。

本研究中鐵棍山藥多糖得率最高為微波-酶劑提取法(13.83%),其次分別為纖維素酶提取法、微波輔助提取法和水提醇沉法。不同方法提取的鐵棍山藥多糖均具有較高的體外抗氧化活性,且在濃度范圍內呈現濃度依賴性。其中,由微波-酶劑協同提取法獲得的多糖DPPH自由基、·OH清除能力最強,在多糖質量濃度3 mg/mL時,對DPPH自由基清除率達到96.37%、·OH清除率為95.32%。采用微波-酶劑提取法多糖的抗氧化活性大于微波輔助法,微波輔助酶提取法效率優勢明顯,其在酶制劑裂解細胞壁的基礎上,通過微波共同作用實現效果遞增優勢,由于淀粉酶和纖維素酶能夠結合微波機械作用,以相對溫和的方式裂解鐵棍山藥細胞壁,客觀提升了鐵棍山藥細胞內部的水分及極性物質熱量生成速率,導致其對細胞壁的壓力增加進而加速細胞破裂,達到對溶出多糖成分提取的效果。因多糖提取工藝不同,在制備條件、操作等外界因素影響下,對鐵棍山藥多糖的提取也會造成差異,此外,微波的非熱效應對化學鍵也會產生作用,有幾率導致減弱亦或者發生斷裂,降解為單糖、低聚糖等被篩除。鐵棍山藥多糖包含單糖種類較多,提取工藝所造成的單糖組成以及摩爾比差異會直觀影響提取多糖的活性,而目前相關研究結論并不統一,因此對于此類表征實驗研究仍有廣闊的潛力與空間。

而微波-酶劑提取法與纖維素酶提取法多糖體外抗氧化活性無顯著差異,表明微波可促進鐵棍山藥多糖提取,但是同時可能會對鐵棍山藥提取多糖的活性產生影響。采用纖維素酶法的提取過程較微波處理更加溫和,其能夠降低機械提取所造成多糖的降解率,使多糖具有更高抗氧化性。此外,纖維素酶提取法提取周期較短,且所需的設備相對簡單,最終多糖得率也較高(>11.0%)。但對于酶劑的類別、使用劑量則需要進行反復篩選,從經濟性以及實用性角度考慮要盡量減少不必要的損耗。

在對人體實施不同運動強度、運動量的刺激之后,皆會引起體內氧自由基的增加[25-26],其增長幅度直接取決于運動強度和量的整體關系,也有研究表明在非高強度、大量運動刺激下,人體的血清MDA、SOD值與安靜狀態下無差異[16,27]。試驗組受試者會隨著訓練量的不斷疊加最終形成運動強度的刺激,從而導致體內抗氧化酶得到迅速動員,如表2所示,試驗組C、D的SOD水平顯著上漲,分別為63.17%、59.02%,可平衡體內大量生成的氧自由基,因此所有受試者訓練后MDA水平均降低。抗氧化趨勢與體外抗氧化能力的結果基本相符。依據試驗組血清肌酸激酶與血清睪酮的測試結果分析,對產后腰痛患者進行亞極量有氧耐力康復運動,并且進行不同鐵棍山藥多糖提取液補充,試驗組與對照組患者都表現出了顯著的運動恢復水平,這與針對性的康復運動手段有直接關系,從短期效果看試驗組患者表現出更快速的恢復能力,并且身體機能在訓練后第二日呈現出不同的超量恢復狀態,尤其以微波-酶提取法配制的營養補充劑干預(試驗組C)效果最為明顯,血清肌酸激酶2次訓練后次日晨分別下降53.07%、55.78%,血清睪酮的訓練后第2日晨上升65.88%。但總體而言,4個試驗組間恢復的差距并不明顯,也客觀說明試驗組產后腰痛患者在運動康復后期,具備了一定的連續運動能力。

此外,本研究對于女性產后腰痛進行運動康復4個試驗組進行28 d不間斷訓練后鐵棍山藥多糖提取液營養補充,不僅彌補了運動當中水分的流失,也滿足了受試者運動恢復過程中糖的即刻攝入,同時補充劑的口感、味道也對受試者運動后神經疲勞以及本能的運動抗拒心理起到緩解作用[28]。更短周期的運動機能水平恢復不僅幫助患者能夠以更積極的心態參與到運動康復訓練當中,也能夠幫助患者在超量恢復的基礎上快速提升生理運動能力水平。

4 結論

通過水提醇沉法、微波輔助提取法、微波-酶提取法、纖維素酶提取法進行鐵棍山藥的多糖提取,實驗顯示微波-酶提取法的多糖得率最高,體外氧自由基清除能力與運動狀態下產后腰痛患者抗氧化能力干預結果相似。鐵棍山藥多糖的結構能有效激活人體的抗氧化酶活性,降低細胞過氧化反應水平,提升產后腰痛患者運動康復過程中氧自由基清除能力,補充運動中糖、蛋白質、維生素等物質的消耗,從而增強人體抗氧化、抗疲勞能力,消除疼痛感,加速生理機能恢復[29]。鐵棍山藥作為日常人們主要食物之一,價格相對低廉,易吸收,并且還具有多樣性的藥用價值,其諸多優點會隨著科學技術的發展以及相關研究的不斷進行而受到更加廣泛的關注,采用最優化加工工藝制作鐵棍山藥營養補充劑,能夠完善產后腰痛運動康復中的營養補充體系,也將成為運動訓練營養補充結構中重要的組成部分。