凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CGMCC 9951提升運動耐力作用的研究

杜釔呈,邢嘉樂,吳影,2,3,田萍萍,2,趙麗娜,2,李欣,2,3,張杰,3,古紹彬,2,3*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471000)2(河南省食品微生物工程技術研究中心,河南 洛陽,471023)3(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心,河南 洛陽,471023)

疲勞是指機體在生理過程中不能維持其機能在特定水平和(或)不能維持預定運動強度的現(xiàn)象[1]。疲勞產(chǎn)生后如果不能及時消除,會進一步發(fā)展成“過勞”,使機體發(fā)生內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降,甚至出現(xiàn)器質性病變。因此,疲勞已成為當今社會威脅人類健康的一大因素。

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種兼性厭氧型革蘭氏陽性益生菌,發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸,對惡劣環(huán)境的耐受性好,因其顯著的益生特性而成為研究的熱點并被逐漸應用。一些腸道菌群通過促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生向腸道上皮細胞提供能量,并且產(chǎn)生興奮類神經(jīng)遞質去甲腎上腺素和多巴胺,從而促進機體的運動能力[2]。HOFFMAN等[3]研究發(fā)現(xiàn),在2周高強度的軍事訓練期間攝入滅活的凝結芽孢桿菌有利于維持機體耐力,減輕炎癥反應。GEPNER等[4]研究發(fā)現(xiàn)攝入凝結芽孢桿菌聯(lián)合羥基丁酸鈣可以減輕高強度軍事訓練引起的炎癥反應,保持肌肉完整性,但相應的機制還需進一步探討。

本研究通過4周游泳訓練建立小鼠運動模型,探究凝結芽孢桿菌對于小鼠運動能力、疲勞相關生化指標以及炎癥因子的影響,為益生菌的利用和抗疲勞產(chǎn)品的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝結芽孢桿菌CGMCC 9951為本實驗室分離保藏菌株,經(jīng)發(fā)酵噴霧干燥后制成菌粉,菌含量2×1010CFU/g。健康的雄性清潔級KM小鼠,體重(25±2)g,購自鄭州大學動物實驗中心,20～22 ℃,自然光照條件下適應性喂養(yǎng)1周。大小鼠維持飼料,北京科澳協(xié)力飼料有限公司。葡萄糖測試盒、糖原測試盒、乳酸測試盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測試盒、血氨測試盒、血尿素氮測試盒、肌酸激酶測試盒,南京建成生物工程研究所。小鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫分析測試盒、小鼠白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒,上海科愛博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州普天儀器制造有限公司;D3024R臺式高速冷凍離心機,美國Scilogex(賽洛捷克)公司;L5S紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;Multiskan FC酶標儀,美國Thermo (賽默飛)公司;CP214電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及干預方法

將50只KM小鼠隨機分為安靜對照組(SC)、運動對照組(EC)和凝結芽孢桿菌低劑量組(LC)、中劑量組(MC)、高劑量組(HC),每組10只,適應性喂養(yǎng)1周,期間小鼠自由進食飲水。在適應性喂養(yǎng)結束后,低、中、高劑量組小鼠飼料機械粉碎后分別添加不同量凝結芽孢桿菌菌粉,用模具壓制成型,低溫烘干備用,制成含有1×106、1×107、1×108CFU/g凝結芽孢桿菌的特殊飼料。在連續(xù)飼養(yǎng)4周時間里,SC組小鼠不進行任何的運動訓練,其余各組小鼠每天固定時間進行15 min的無負重游泳訓練,實驗期間小鼠自由進食和飲水,每隔3 d稱量一次體重。該研究內(nèi)容和過程遵循國際及國家頒布的有關生物醫(yī)學研究所制訂的倫理學標準(SYXK-(豫)2018-0010)。

1.3.2 日常小鼠游泳訓練

小鼠游泳實驗方案參考文獻[5]所述方法并稍加改動,每天下午兩點對EC、LC、MC、HC組小鼠進行無負重游泳實驗,泳池水溫(28±1)℃,水深為小鼠體長的1.5倍,使其尾部不能觸底支撐。小鼠游泳時間為15 min,持續(xù)訓練4周。

1.3.3 游泳力竭時間的測定

訓練4周后,進行力竭游泳試驗。將小鼠單獨放置在自制游泳池(長50 cm、寬35 cm、高40 cm)中,水溫維持在(28±1)℃,將相當于體重5%的鉛皮附著在小鼠尾根上,記錄從入池開始到力竭的時間。當小鼠沉水后8 s內(nèi)未上浮至水面為力竭判斷標準[6]。

1.3.4 取樣

游泳力竭時間測定后,小鼠休息24 h,期間正常飲水和飲食。之后禁食12 h,無負重游泳15 min,將小鼠取出,休息30 min。用乙醚麻醉小鼠后,摘除眼球取血。將血液4 ℃靜置1 h,3 500 r/min離心10 min后,將分離的血清樣品置于4 ℃冰箱備用。取血后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,解剖,取出肝臟和骨骼肌組織,用生理鹽水洗去血液并用濾紙吸干水分,液氮冷凍備用。

1.3.5 小鼠血清生化指標的測定

嚴格按照試劑盒說明書的方法,用酶標儀測定小鼠血清中葡萄糖的含量,采用比色法測定小鼠血清中乳酸、LDH、血氨、血尿素氮、肌酸激酶含量,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠血清中IL-1β、IL-10、TNF-α含量。

1.3.6 小鼠肝糖原和肌糖原含量的測定

將一定量的肝臟和肌肉按不同比例加入堿液制成糖原水解液,進而制備成1%肝糖原檢測液和5%肌糖原檢測液,根據(jù)試劑盒說明書要求,在620 nm下檢測吸光度,根據(jù)標準曲線分別計算出肝糖原和肌糖原的含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,組間差異分析采用單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA),數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示,P<0.05表示組間有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌對小鼠體重和游泳力竭時間的影響

由圖1-a可知,5組小鼠的初始體重沒有顯著性差異,在連續(xù)4周補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951后,5組小鼠體重均有不同程度的增加,其中EC組比LC、MC、HC組分別多了8.1%、6.1%、7.4%,比SC組多了14.8%,但均無顯著性差異(P>0.05)。表1列出了小鼠基本參數(shù),結合圖1-a和表1數(shù)據(jù)可知,在各組小鼠日均攝食質量沒有顯著性差異的情況下,實驗組小鼠與對照組小鼠最終體重未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05),各臟器指數(shù)也無顯著性差異(P>0.05),表明4周游泳運動期間攝入凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對小鼠體重和臟器重量無不良影響。

表1 小鼠基礎參數(shù)

圖1 凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對小鼠體重(a)和游泳力竭時間(b)的影響

游泳力竭時間是描述運動耐力最直觀的數(shù)據(jù)。由圖1-b可知,4周的日常游泳訓練后,EC組游泳時間是SC組的2.2倍,差異顯著(P<0.05),說明日常訓練可以顯著延長小鼠游泳力竭時間,提高小鼠的耐力表現(xiàn)。而補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951的LC、MC、HC組的游泳力竭時間分別是EC組的1.2、2.0、3.3倍,差異顯著(P<0.05)。

2.2 凝結芽孢桿菌對小鼠血清生化指標的影響

2.2.1 血糖

血糖是機體運動時的直接供能物質。如圖2-a所示,4周游泳訓練后,相比較SC組,EC組小鼠在運動一段時間后血清中血糖含量提升了17.2%,但差異不顯著(P>0.05)。而在日常游泳訓練中補充凝結芽孢桿菌,HC組小鼠在運動后血糖含量比EC組提高了17.0%,差異顯著(P<0.05)。

a-血糖;b-乳酸;c-乳酸脫氫酶;d-肌酸激酶;e-血氨;f-血尿素氮

2.2.2 乳酸

當運動強度超過機體有氧代謝能力時,乳酸就會產(chǎn)生并在體內(nèi)積累,使肌肉酸化導致疲勞。如圖2-b所示,4周游泳訓練后,SC組和EC組的乳酸含量分別為4.16、4.35 mmol/L,組間差異無統(tǒng)計學意義。而攝入凝結芽孢桿菌的LC、MC、HC組小鼠血液的乳酸水平分別為3.47、3.02、2.45 mmol/L,MC組和HC組乳酸量顯著低于EC組(P<0.05),說明在4周游泳運動期間攝入凝結芽孢桿菌可以降低機體內(nèi)乳酸的積累。

2.2.3 LDH

LDH主要催化丙酮酸和乳酸之間的可逆性反應,是機體糖無氧代謝途徑的一種重要的酶[7]。如圖2-c所示,4周游泳訓練后,EC組小鼠的LDH水平與SC組差異不顯著(P<0.05)。在4周小鼠運動期間每天補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,MC組和HC組小鼠血清LDH水平顯著降低(P<0.05)。

2.2.4 肌酸激酶

肌酸激酶是機體磷酸原供能系統(tǒng)代謝的關鍵酶之一[8]。如圖2-d所示,4周游泳訓練后,EC組肌酸激酶水平顯著低于SC組(P<0.05)。在小鼠4周游泳運動期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,攝入凝結芽孢桿菌的MC、HC組小鼠血液的肌酸激酶水平顯著降低(P<0.05),而LC組與EC組之間無顯著差異(P>0.05)。隨著劑量的升高,3個劑量組的肌酸激酶活性均逐漸下降,差異顯著(P<0.05)。

2.2.5 血氨

氨是運動代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的代謝物。如圖2-e所示,游泳訓練4周后,EC組小鼠血氨水平顯著低于SC組(P<0.05)。在4周游泳訓練期間攝入凝結芽孢桿菌CGMCC 9951后,相比于EC組,各實驗組小鼠血氨水平均有所下降,且MC、HC組小鼠與EC組小鼠血氨水平差異顯著(P<0.05),而MC、HC之間無顯著差異(P>0.05)。

2.2.6 血尿素氮

血尿素氮是蛋白質有氧代謝的產(chǎn)物,機體對運動負荷的適應能力越差,血清尿素氮的增加就越明顯[9]。如圖2-f所示,游泳訓練4周后,EC組和SC組之間血尿素氮水平無顯著差異(P>0.05),在運動過程中攝入凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,各攝菌組之間血尿素氮水平差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 凝結芽孢桿菌對小鼠肝糖原和肌糖原的影響

肝糖原和肌糖原是機體內(nèi)糖儲備的2種不同形式,能夠為機體提供運動所需要的能量,維持血糖水平。如圖3-a所示,4周游泳訓練后,與SC組相比,EC組小鼠肝糖原水平顯著升高(P<0.05)。在小鼠游泳訓練期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,攝菌各組小鼠肝糖原水平均隨劑量增加而顯著提升,且3個劑量組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如圖3-b所示,4周游泳訓練后,與SC組小鼠相比,EC組小鼠肌糖原水平無顯著差異(P>0.05)。在小鼠游泳訓練期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,各劑量組小鼠肌糖原水平顯著升高(P<0.05),且MC、HC組之間小鼠肌糖原水平差異顯著(P<0.05)。以上結果表明凝結芽孢桿菌CGMCC 9951可以通過提升肝糖原與肌糖原水平,增強運動過程中能量的持續(xù)供應。

a-肝糖原;b-肌糖原

2.4 凝結芽孢桿菌對小鼠血清炎癥因子的影響

IL-1β是IL-1家族中的重要成員,具有較強的促炎活性,可誘導多種促炎介質,如細胞因子和趨化因子,并最終導致廣泛的炎癥事件,因為其在炎癥相關疾病中的重要作用而受到廣泛關注[10]。如圖4-a所示,4周游泳訓練后,與SC組相比,EC組小鼠血清IL-1β水平降低無顯著差異(P>0.05)。在小鼠4周游泳訓練期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,LC組小鼠血清IL-1β水平變化無顯著差異(P>0.05),而HC組血清IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。

a-IL-1β;b-TNF-α;c-IL-10

與IL-1β相似,TNF-α是一種多效促炎細胞因子,屬于TNF配體超家族。TNF-α在調(diào)節(jié)多種發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮著不同的作用,包括炎癥、分化、脂質代謝和凋亡,與多種疾病有關[11]。如圖4-b所示,4周游泳訓練后,與SC組相比,EC組小鼠血清TNF-α水平顯著下降(P<0.05),在小鼠游泳訓練期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,MC、HC組小鼠血清TNF-α水平顯著下降(P<0.05),而LC組小鼠無顯著差異(P>0.05)。

IL-10是一種研究較為廣泛的抗炎細胞因子,可拮抗其他細胞因子的促炎作用,從而控制炎癥。如圖4-c所示,4周游泳訓練后,與SC組相比,EC組小鼠血清IL-10水平無顯著差異(P>0.05)。在小鼠游泳訓練期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,LC組小鼠血清IL-10水平無顯著差異(P>0.05),而MC、HC組小鼠血清IL-10水平顯著升高(P<0.05)。

3 討論

機體疲勞最直接、客觀的表現(xiàn)就是運動耐力的下降,而游泳力竭時間是表現(xiàn)機體耐力最常用的一項指標。本研究發(fā)現(xiàn),在4周游泳訓練期間每天補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951能夠顯著提升小鼠的游泳力竭時間,且隨著凝結芽孢桿菌劑量的增加,耐力提升作用更明顯,各組小鼠體重、各臟器重量及臟體比無顯著差異。標志運動性疲勞發(fā)生的生化指標主要包括能量物質(血糖、糖原等)、代謝調(diào)節(jié)物質(酶、激素等)以及代謝產(chǎn)物(乳酸、氨、尿素氮等)。肝糖原和肌糖原是機體內(nèi)儲存糖的2種形式,是糖代謝中重要的能源物質,提高糖原的儲備量有助于長時間維持血糖的穩(wěn)定。之前有研究表明,用枯草芽孢桿菌GD1、枯草芽孢桿菌N4等多種菌株發(fā)酵的大豆產(chǎn)品能夠顯著提升高強度運動中小鼠肝糖原水平,并減少代謝產(chǎn)物的累積[12]。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn),同時服用酵母多肽和干酪乳桿菌會對運動20 min后的小鼠血糖水平產(chǎn)生顯著影響。與前人研究結果類似,本實驗表明連續(xù)4周服用凝結芽孢桿菌CGMCC 9951能夠顯著提升小鼠肝糖原和肌糖原儲備水平,且高劑量的凝結芽孢桿菌可以顯著提高小鼠血糖水平,這意味著機體在運動中將會獲得更充足的能量供給,從而達到增強運動能力,延緩機體疲勞的作用。

LDH是機體糖酵解供能系統(tǒng)的關鍵酶之一,在糖的無氧酵解中催化丙酮酸加氫生成乳酸的可逆反應,LDH主要存在于骨骼肌內(nèi),保證肌肉在短暫缺氧時仍能獲取ATP,體現(xiàn)了糖酵解系統(tǒng)供能特性[14]。李開剛等[15]對大鼠進行16周不同強度的訓練后發(fā)現(xiàn),骨骼肌LDH活性在各訓練組有下降的趨勢。魏海成等[16]研究發(fā)現(xiàn),當組織被破壞時,LDH從細胞內(nèi)進入血液,從而導致血清中的酶活性升高。肌酸激酶是一種血漿非功能性酶,正常來源于骨骼肌。運動會使機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生劇烈變化,肌肉組織因缺氧和細胞損傷導致代謝物累積,血清中的肌酸激酶含量就會發(fā)生變化,所以通常將肌酸激酶作為骨骼肌損傷的指標[17]。CHEN等[18]研究發(fā)現(xiàn),補充植物乳桿菌TWK10可以顯著降低小鼠血清中肌酸激酶水平。與前人研究結果相似,本研究發(fā)現(xiàn),與EC組相比,補充一定劑量的凝結芽孢桿菌CGMCC 9951可以顯著降低HC組小鼠血清中LDH和肌酸激酶水平,表明凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對運動引起的細胞和肌肉損傷有一定的改善作用。

運動性疲勞的生物標志物包括乳酸、血氨、血尿素氮等。乳酸是肌肉在進行高強度運動時,從厭氧糖酵解途徑獲得足夠能量的同時產(chǎn)生的副產(chǎn)物。過量的乳酸會使肌肉中H+和H3PO4堆積,導致肌肉pH值下降,抑制磷酸果糖激酶活性,從而降低糖的分解速度,使基質網(wǎng)結合更多的Ca2+,影響肌肉張力[19]。血氨主要由腸道及細菌酶的氨基酸脫氨反應和骨骼肌的運動代謝產(chǎn)生,骨骼肌ATP大量消耗,ADP再磷酸化速率慢于ATP水解的速率,ADP水平升高導致腺苷酸脫氨酶活性升高,產(chǎn)氨增加,造成疲勞[20]。血尿素氮是人體蛋白質代謝的主要終產(chǎn)物。當機體長時間運動以至于不能夠通過糖和脂肪的分解獲得足夠的能量時,骨骼肌中蛋白質和氨基酸參與分解代謝提供能量,產(chǎn)生尿素氮。彭曉明等[19]探究安神益智合劑對力竭小鼠抗疲勞特性的影響,結果表明安神益智合劑給藥組小鼠血清乳酸、LDH和血尿素氮含量均降低。萬麗娜等[21]研究發(fā)現(xiàn)鎖陽乙醇提取物可以顯著減少小鼠血清中乳酸、血尿素氮含量。尹美玲等[22]研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可以顯著降低體力疲勞小鼠血清乳酸、血尿素氮的含量,具有緩解體力疲勞的作用。本實驗結果表明,在4周游泳訓練過程中補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,與EC組相比,MC、HC組均能夠顯著降低小鼠血清中乳酸和血氨的水平,而血尿素氮水平差異不顯著。之前有研究表明,服用植物乳桿菌TWK10對運動后小鼠血尿素氮的清除作用不顯著[18],相關機制還需進一步研究。

IL-1β是一種多效促炎因子,可以促進其他炎癥因子的表達。TNF-α是一種關鍵的促炎因子,可與多種細胞因子協(xié)同作用,進一步誘導體內(nèi)炎癥介質的釋放。IL-10是一種抗炎因子,可抑制促炎因子的釋放,減少炎癥反應。JGER等[23]研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌FP4和短雙歧桿菌BR03可以緩解炎癥反應,增強肌肉運動能力。LEE等[24]研究表明植物乳桿菌HY7715可以提高骨骼肌質量,降低機體炎癥反應。BINDELS等[25]發(fā)現(xiàn)補充特定量的乳酸菌可以降低炎癥反應,緩解肌肉疲勞。本研究表明,與EC組相比,在4周游泳訓練期間補充凝結芽孢桿菌CGMCC 9951可以顯著降低HC組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平,提升IL-10水平,緩解因運動導致的肌肉炎癥反應,減少細胞膜通透性,從而緩解運動性疲勞。

4 結論

凝結芽孢桿菌CGMCC 9951可以顯著延長小鼠游泳力竭時間,提高小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原儲備,提升運動后血糖水平。降低疲勞相關指標乳酸、血氨、BUN水平,降低運動后血清LDH、CK活性。降低促炎細胞因子(IL-1β和TNF-α)和提高抗炎細胞因子(IL-10)的含量,進而達到增強小鼠運動耐力,緩解疲勞的作用。

目前凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對運動耐力的調(diào)節(jié)尚停留在表觀研究,有待從肌肉組織形態(tài)、腸道微生物多樣性、代謝組學以及與運動相關的信號通路等方面來揭示凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對運動耐力調(diào)節(jié)的深層機制。此外,與動物相比,人類具有不同的飲食、生活方式和腸道菌群,凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對于人體運動耐力的作用機制仍需進一步研究。