基于體外發酵模型研究膳食多糖對腸道菌群色氨酸代謝的影響

何袁,高文玉,王心怡,陸文偉,2,王鴻超,2*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)2(國家功能食品工程技術研究中心(江南大學),江蘇 無錫,214122)

過敏是全球日益嚴重的公共問題,據世界過敏組織(World Allergy Organization,WAO)報道,過敏性疾病已成為全球第六大疾病,給全世界30%～40%的人群造成了生活上的困擾。近年來,我國的過敏發病率也在不斷升高,估計患病人數超過2億。對于過敏癥狀,積極預防和治療是關鍵。然而目前治療過敏最有效的方法之一是嚴格避免接觸過敏源。治療過敏的藥物也存在個體差異性,更不利的是長期使用藥物會產生一定副作用。因此,尋找安全的、能夠降低患者敏感性的天然抗過敏物質,開發預防性或治療性干預方法,對于降低過敏發生風險,提高過敏患者生活質量至關重要。

越來越多的證據證明,腸道菌群的健康狀態影響宿主的健康狀況,并且眾多疾病的發生都能從腸道菌群中找到答案[1]。腸道菌群及其代謝物可作為緩解甚至治療過敏的靶點[2-3]。研究發現過敏兒童的腸道菌群失調、促炎潛力升高、降解纖維能力減弱[4]。然而將碳源從糖類轉為色氨酸(tryptophan,Trp),腸道中高度適應性的乳酸桿菌會加速生長并產生芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)的配體吲哚-3-乙醛(indole-3-aldehyde, IAId),促進白介素22(interleukin,IL-22)轉錄[5],針對色氨酸—菌群—芳香烴受體配體—免疫調節這一通路,又發現羅伊氏乳桿菌代謝色氨酸產生吲哚-3-乙酸(indole acetic acid, IAA),促進腸上皮T細胞增殖[6]。一項哮喘小鼠實驗表明色氨酸代謝物犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)通過調控Th17、Treg比例,有利于形成免疫耐受或者逆轉免疫耐受缺陷達到防治哮喘的目的[7]。這明確說明腸道菌群代謝色氨酸產生的某些物質,影響機體免疫平衡,這使菌群代謝飲食中色氨酸改善機體過敏癥狀成為可能。天然來源的多糖、寡糖等物質具有抗過敏的功能,其能夠與過敏原結合,修飾或者包埋過敏表位;調節過敏原的呈遞過程,改變T細胞的分化方向;提升腸上皮細胞的緊密連接性或阻礙肥大細胞、嗜堿性粒細胞的脫顆粒現象,減少促炎因子產生[8]。同時多糖可改變腸道微生物組成,影響基于腸道菌群作用下的色氨酸代謝通路。本研究通過體外發酵模型探究多種膳食多糖對菌群的影響,檢測糞便中腸道微生物結構組成及色氨酸代謝產物的變化,篩選潛在適合過敏人群的膳食因子。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

PB3002-N型電子天平,梅特勒托多儀器(上海)公司;厭氧工作站400TG,英國Eletrotek公司;ZHJH-C1115B型超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;高溫高壓滅菌鍋,SANYO公司(日本);高速冷凍離心機,Eppendorf 公司;FE-20精密pH計,梅特勒-托利儀器(上海)有限公司;振蕩器,德國IKA集團;Vanquish Q Exactive Plus超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀,美國賽默飛世爾科技公司;llumina miseq pe300高通量測序儀,美國llumina公司。

表1 膳食多糖分組信息

1.2 體外發酵模型

體外發酵模型參考文獻[10-11]的方法并做調整,最終發酵體積2 mL,24孔板加入0.4 mL糞便勻漿液和1.6 mL培養基。將孔板放入厭氧箱[V(N2)∶V(CO2)∶V(H2)=8∶1∶1]中發酵24 h,膳食多糖添加量為0.5%,設置2種不同的對照組(陽性對照采用可溶性淀粉,空白組不添加碳源)。所有膳食多糖平行發酵3次。發酵結束后放于4 ℃冰箱過夜以停止微生物活動。并將發酵液于8 000×g,4 ℃離心10 min,收集上清液于-20 ℃冰箱等待代謝組檢測,下部沉淀菌泥等待提取DNA。

1.3 糞便收集及處理

采集7份(年齡在14～25歲,女,無特殊飲食習慣及生活方式不發生變化)新鮮糞便,要求在近6個月未患有便秘、腸炎等消化性疾病以及未長時間服用益生菌等,同時在近3個月內未服用抗生素等藥物。所有人群的糞便立即收集于采集管中,并放入厭氧產氣袋,盡快進行后續發酵實驗。在厭氧工作箱中稱取糞便樣品重量,按1∶10(體積比)加入滅菌的pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)稀釋糞便,渦旋混勻。

1.4 16S rRNA測序

按試劑盒要求提取發酵后糞便的DNA及其膠回收,即針對微生物rRNA V3～V4區的特異性引物進行PCR擴增。PCR時正向引物5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和反向引物5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′。對瓊脂糖凝膠電泳后的膠塊進行切膠和DNA純化。在MiSeq PE300 (Illumina)平臺測序。菌群測序結果經過合并雙端及質控,利用QIIME2(https://view.qiime2.org/)平臺分析。利用最新的Silva 16 s rRNA v132數據庫對物種進行注釋。本研究選取相對豐度在一個樣本中至少大于千分之一的屬進行分析。基于篩選后的屬水平物種豐度表作為原始數據集。產生的代表性序列操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)通過總和縮放進行標準化,采用Mann-Whitney/Kruskal-Wallis檢驗(非參數)比較兩組間α多樣性。通過基于Bray-Curtis index的非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)計算菌群β多樣性,使用相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)進行數據統計,計算顯著性。

1.5 色氨酸靶向代謝檢測

吸取離心后的發酵上清液至無酶EP管中,加入混合液[V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(異丙醇)=8∶1∶1]后置于冰上以沉淀蛋白,隨后真空濃縮直至水分蒸發,加入10%甲醇水重懸離心過膜等待上機檢測。采用ACQUITY UPLC?BEH C18 1.7 μm (100 mm×2.10 mm)色譜柱,柱溫36.5 ℃,自動進樣溫度為4 ℃。流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水。梯度洗脫時采用先A液再B液洗脫,最后平衡至20 min。

1.6 數據處理

色氨酸代謝物數據分析,使用 GraphPad Prism version 8軟件進行統計分析。采用單因素方差分析(one-way variance analysis,ANOVA)比較多組間的差異,然后采用Duncan’s new multiple range檢驗。結果以平均值±標準誤差表示。色氨酸代謝物和菌群屬水平的相關指數和P值使用雙端檢測的spearman計算。當P<0.05時,用*表示;當P<0.01,用**表示;當P<0.001,用***表示,組間差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 膳食多糖改變腸道菌群α多樣性

腸道微生物能夠通過分泌碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzyme,CAZyme)分解多糖[12],而多糖反過來又能增加腸道中的益生菌比例,調節微生物組成,從而維持宿主健康[13]。研究發現,與免疫功能相關的膳食多糖種類集中在菌菇類多糖,除此之外還有藥食同源類植物多糖,本研究篩選了24種多糖(表1),探究了其對菌群的調節作用。菌菇的營養保健功能很大程度上歸功于其含有的生物活性物質,像靈芝多糖、香菇多糖、牛樟芝多糖、猴頭菇多糖等菌菇多糖,是具有藥理活性的“活性多糖”,化學結構為三維螺旋狀的β型多糖,可激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞等,促進細胞因子生成,對免疫系統發揮多方面的調節作用,同時它們被腸道微生物利用,產生短鏈脂肪酸等有利代謝產物,起到免疫調節作用(相關數據請見增強出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034677)。為了驗證這些多糖對人類腸道菌群的調節作用,將其加到人類新鮮糞便中進行體外發酵實驗。采用Evenness、Observed OTUs和Shannon三種α多樣性指數探究膳食多糖對腸道菌群的豐富度和均勻度的影響。Evenness 指數是最常用的均勻度指數,Observed OTUs指數主要表示某一群落中的物種豐富度,Shannon指數則反映群落中物種的豐富度、均勻度及穩定性。如圖1所示,對比加入的可溶性淀粉的對照組,黃芪多糖、褐藻多糖、大棗多糖、山藥多糖、銀耳多糖、牛樟芝多糖和黃精多糖顯著提升Evenness指數(P<0.05),姬松茸多糖、樹舌靈芝多糖、猴頭菇多糖、香菇多糖、山藥多糖、白耙齒菌多糖、木耳多糖和黃精多糖顯著提升Observed_OTUs指數(P<0.05),大棗多糖、牛樟芝多糖和黃精多糖顯著提升Shannon指數(P<0.05)。表明大棗多糖、牛樟芝多糖、黃精多糖顯著提高了腸道微生物的豐富度和均勻度,改善腸道菌群組成,而其他多糖對菌群多樣性調節不顯著。

a-Evenness;b-Observed_OTUs;c-Shannon

2.2 膳食多糖改變腸道菌群β多樣性

基于Bray-Curtis相似性的NMDS對膳食多糖發酵后腸道菌群的整體結構進行分析,不同的膳食多糖對菌群整體組成結構影響不同。NMDS結果的評估標準是Stress值,為樣品在降維后形成的空間距離與其在原始多維空間距離的差值,越小越好,說明在低維空間更完整地捕獲了高維空間的信息。通過比較2個群落微生物組成上的差異,發現靈芝多糖、蛹蟲草多糖、褐藻多糖、金針菇多糖和茯苓多糖的Stress值<0.2,顯著改變菌群β多樣性(P<0.05)(表2,圖2)。腸道中的共生菌能利用多糖,同時多糖含量及化學組成的變化也影響著腸道微生物,他們共同塑造了一個動態的、變化的腸道環境。靈芝多糖對特異性免疫和非特異性免疫都有一定作用,并且研究人員證實靈芝多糖及其水解物可以改善菌群結構及其代謝產物,從而增強腸黏膜免疫[14]。褐藻多糖在體內、體外實驗中都不被消化酶降解,其可作為腸道菌群的碳源,通過調節腸道菌群,產生短鏈脂肪酸,直接與免疫細胞toll樣受體作用并產生黏蛋白增強免疫應答[15]。喂食靈芝多糖及茯苓多糖后,降低小鼠腸道菌群OTU多樣性并顯著重塑腸道菌群的組成,糞便中可抗肥胖、產短鏈脂肪酸、降解多糖/木聚糖、產生乳酸的細菌的豐度顯著增加[16]。

a-靈芝多糖;b-黃芪多糖;c-蛹蟲草多糖;d-白樺茸多糖;e-褐藻多糖;f-金針菇多糖;g-猴頭菇多糖;h-茯苓多糖

表2 膳食多糖發酵后菌群結構差異值

2.3 膳食多糖影響腸道菌群物種組成

對膳食多糖干預后的腸道菌群門、屬水平進行物種組成分析,計算厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的比值(F/B)。在門水平上,腸道菌群主要是由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)構成(圖3)。對比空白組,灰樹花多糖、金針菇多糖和猴頭菇多糖可顯著提高F/B值(P<0.05,圖4)。從屬水平上發現靈芝多糖、黃芪多糖、蛹蟲草多糖、白樺茸多糖、褐藻多糖、金針菇多糖、猴頭菇多糖和茯苓多糖的攝入促進Lactobacillus和Bifidobacterium的相對豐度(圖5)。研究表明調節整體腸道菌群結構組成的靈芝多糖不僅可以減少胰島素抵抗,逆轉高脂飲食誘導的小鼠肥胖、高脂血癥、脂肪積累等,還改善小鼠的腸道屏障功能,更為重要的是Lactobacillus在小鼠腸道內得到富集[17]。最近研究表明,白樺茸抗病毒和消炎的作用非常顯著,在體外或許能夠抑制RNA和DNA病毒。該研究強調了白樺茸具有強大的酶系統和防御系統,被證明可以抑制與 COVID-19 相關的促炎細胞因子,并幫助防止“細胞因子風暴”壓倒免疫系統[18],這是因為從白樺茸子實體中提取的多糖是一種關鍵的免疫調節活性物質和信號分子,有助于支持免疫系統的恢復。金針菇多糖促進小鼠擬桿菌門豐度,降低結腸中的致病菌[19],對于免疫系統,其抑制了造模引起的血清IgA、IL-6、TNF-α升高,并且促進了抗炎因子IL-10產生[20]。

圖3 腸道菌群的門水平組成

圖4 腸道菌群的F/B值

圖5 膳食多糖對腸道菌群屬水平組成的影響

2.4 膳食多糖改變腸道菌群色氨酸代謝

多種色氨酸代謝物是有利于機體的小分子物質,其已被證實有與細胞因子表達相關的抗炎作用,促進Th1細胞的免疫反應,抑制Th2細胞免疫反應的發展和過敏抗體(IgE)產生,從機制上緩解過敏反應。通過糞便發酵液的靶向代謝組學檢測色氨酸代謝物,發現前述顯著改變腸道菌群β多樣性的靈芝多糖、蛹蟲草多糖、褐藻多糖、金針菇多糖和茯苓多糖不能增加糞便中色氨酸代謝物KYN、IPA和IAA的含量(圖6-a～圖6-c),但ILA和I3C含量增加(圖6-d,圖6-e),尤其是褐藻多糖和茯苓多糖。事實證明,增加腸道多糖的可用性可以促進微生物色氨酸降解,從而導致大腸和血清中色氨酸及其代謝物水平的改變[20-21],影響體內循環色氨酸。據報道ILA在雙歧桿菌占優勢的嬰兒糞便中濃度很高[22],另一項研究證實雙歧桿菌表達的人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)代謝基因激活了色氨酸代謝通路,增加ILA,維護腸道及外周免疫系統穩態,抑制過度免疫反應的發生從而減少母乳喂養嬰兒的腸道炎癥[18]。本研究通過菌群和色氨酸代謝物關聯分析,同樣發現ILA與Lactobacillus和Bifidobacterium呈正相關(圖7)。由此可見,腸道微生物可利用諸如褐藻多糖、茯苓多糖等物質產生有利的代謝產物,以此達到改善機體免疫促進健康的作用。

a-犬尿氨酸(Kyn);b-吲哚丙酸(IPA);c-吲哚-3-乙酸(IAA);d-吲哚乳酸(ILA);e-吲哚-3-甲醛(I3C)

圖7 腸道菌群與色氨酸代謝物的相關性分析

3 結論與討論

全球范圍內過敏發生率逐年增加,某些過敏性疾病已成為人們日益關注的公共衛生問題,這給社會、家庭和個人帶來了嚴重負擔。隨著人們對過敏的發生發展研究的加深,發現腸道微生物在過敏中的作用不可忽視,多項研究也探討了腸道微生物群落與過敏性疾病之間的聯系,確定了不同過敏癥的微生物特征,盡管結論不能夠統一[23],但它們確定了過敏人群的α多樣性指數(Chao1和Shannon)低于正常人群,過敏患者色氨酸代謝能力下降及代謝物含量降低[24]。

本研究發現在體外發酵模型中,膳食多糖不僅改變糞便菌群也促進了色氨酸代謝過程,這為改善過敏體質及開發適合過敏人群功能食品提供了基礎數據。腸道微生物顯著變化尤其是Lactobacillus和Bifidobacterium相對豐度增加,在褐藻多糖和茯苓多糖干預下菌群色氨酸代謝能力強,ILA、I3C含量增加。此外ILA與糞便中Lactobacillus和Bifidobacterium呈正相關。據報道,Lactobacillus和Bifidobacterium能夠緩解食物過敏性腹瀉或其他過敏癥狀[25-26],例如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌能夠在結腸中產生I3C和ILA,激活AhR介導的免疫反應[24,27]。由此看來褐藻多糖和茯苓多糖或許可以通過調節腸道菌群,增加Lactobacillus和Bifidobacterium豐度進而改善色氨酸代謝過程,提高ILA和I3C含量,從而改善機體過敏癥狀。膳食多糖到達人體結腸并被腸道菌群發酵利用,從而可能通過依賴菌群的機制影響腸道健康,后續需進行膳食多糖在口腔及胃腸道的連續消化環節,除此之外還需關注糞便菌群發酵后的多糖結構組成變化及除色氨酸代謝物以外的其他菌群代謝物含量變化,同時體外發酵實驗結果并不能完全代表人們食用膳食多糖的體內情況,還需進一步開展動物實驗或者人群實驗驗證該2種多糖物質對過敏的作用。